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目的:通过跟踪猪胚胎孵化前、孵化后上、下胚层和中胚层分化以及进入体节期后器官原基发生过程中的形态学特征,结合胚层分化分子标记研究,希望系统深入认知猪早期胚胎发育的特征,为猪作为人类医学动物模型奠定基础。 方法:收集体内Days(D)0.5-18胚胎,通过体视显微镜跟踪外观形态学特征;通过半薄切片观察D7-13.5孵化胚胎胚盘建立以及中胚层分化过程中的形态结构特征;全胚免疫荧光和全胚免疫组化切片鉴定胚层分化中GATA结合蛋白6(GATAbinding protein6,GATA6),波形蛋白(VIMENTIN),POU转录因子4(Octamer-binding transcription factor4,OCT4)和SOX2 SRY-related HMG-boxgene2的定位;应用Real time PCR检测胚层分化相关基因的表达;对进入体节时期D14-18.5胚胎进行石蜡切片HE染色跟踪器官发生。 结果: 1、获得了猪体内D0.5-6.5胚胎从合子期到扩张囊胚期的发育形态学数据以及对应发育时程,D1.5为2-细胞;D2.5为4-细胞;D3.5为8-细胞;D4.5为桑葚到早期囊胚期;D5.5为囊胚期;D6.5为扩张囊胚期。 2、形态学观察得出在D7囊胚孵化;孵化后囊胚形态经历了从圆形、卵圆、管状到线型变化;D11,出现管状和线型形态;D12,以线型孕体为主。 3、切片显示刚刚孵化胚胎中,下胚层从内细胞团(innercell mass,ICM)中分化出来,位于其下方;在胚盘建立过程中,下胚层沿滋养外胚层(trophectoderm,TE)迁移形成壁内胚层;Raubers layer覆盖的上胚层细胞间出现空腔,随着raubers layer的消失,此腔打开,胚盘建立,之后胚盘加厚,上胚层出现假复层结构。进入原条期,形态学观察显示猪胚体一端出现月牙形增厚,加厚区域的上胚层下方中胚层细胞迁移进入胚外区域。D13,脊索出现,胚内中胚层细胞从脊索开始沿着TE和原始内胚层两侧对称迁移至胚外区域,与TE和原始内胚层组成的胚外体腔。 4、免疫组化分析表明GATA6在壁内胚层表达;SOX2在ICM和胚盘形成中的上胚层(epiblast,Epi)定位;OCT4在刚刚孵化胚胎的ICM和TE定位,胚盘建立中逐渐定位于Epi,进入原条期,OCT4在上胚层后端、原条区域和迁移到胚盘下方的细胞中弱表达;VIMENTIN在胚盘中后端、原条及迁移到胚盘下方的细胞高表达,原条前端的上胚层弱表达。 5、体节时期,D14.5,形成3-8对体节,胚体呈现圆柱形,中胚层分化成轴旁、间介和侧中胚层,内胚层分化成前、中、后肠;D15.5,形成14-15对体节,羊膜融合包裹胚体,胚体弯曲形成“C”型胚胎,心脏发生,前肾形成;D16.5,中肾形成,出现肝、胃原基、额鼻隆起;D17.5,指芽出现;D18.5,可见眼的发生,有口凹形成,头侧顶端可见端脑,心室发生分隔。 结论: 1、胚盘发育中,D8-9,胚胎呈圆形,壁内胚层形成,上胚层细胞中的空腔在D10左右随着Raubers layer消失,胚盘建立而消失;其间GATA6能标记壁内胚层,OCT4和SOX2能标记Epi。 2、VIMENTIN能鉴定出猪中胚层从原条后端开始,沿着原条向后和两侧在胚外外胚层下方迁移模式形成。 3、猪胚胎发育D14.5,形成3-8对体节;D15.0-18.5时心、肝、肾、脑、肺、胃及肢芽等原基已发生。