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背景:目前，自体软骨细胞移植术(ACI)是治疗关节软骨缺损的“金标准”。体外软骨细胞扩增是进行ACI手术的关键步骤。在体外软骨细胞扩增过程中，软骨细胞易发生去分化，导致软骨细胞表型丧失，产生以Ⅰ型胶原(COL-1A1)为主的纤维软骨基质，严重影响ACI治疗关节软骨缺损的疗效。因此，有关软骨细胞去分化的具体调控机制，以及通过抑制软骨细胞去分化，从而维持软骨细胞表型成为软骨组织工程领域的研究热点。 目的:本研究旨在建立可用于人关节软骨缺损修复的自体软骨细胞体外扩增体系;进一步探讨DNA甲基化在软骨细胞去分化中的可能机制，为优化ACI的种子细胞提供理论基础。 方法:关节镜下从膝关节非负重区取约100mg软骨;建立GMP软骨细胞培养体系，体外扩增单层培养软骨细胞，收集第二代(P2)以前的细胞，做为临床ACI治疗的种子细胞。通过细胞单层传代培养建立人软骨细胞去分化模型;观察DNA甲基化抑制剂5-AzaC对软骨细胞去分化的影响;利用甲基化芯片和焦磷酸测序，探讨软骨细胞去分化中和5-AzaC处理后的表观遗传学变化;通过实时定量PCR和蛋白印迹检测分别检测COL-1A1、DNMT3A和DNMT3B的表达情况，探讨参与调控软骨细胞去分化过程中的关键DNA甲基化转移酶;利用基因过表达和基因干扰技术，探讨miR-29b在DNMT3A调控软骨细胞去分化中的作用。 结果:经过约10天的体外培养，软骨细胞数量从PO代的1×105扩增到P2代的107，Ⅱ型胶原和Aggrecan表达阳性;对扩增培养软骨细胞后的培养基上清进行细菌、真菌和支原体培养检测，结果为阴性，内毒素检测低于0.5EU/ml;随着传代次数的增加，软骨细胞发生去分化，基因CpG位点平均甲基化率升高，COL-1A1基因启动子区域甲基化程度降低，COL-1A1基因mRNA表达水平升高;利用5-AzaC处理后，COL-1A1基因启动子区域甲基化程度升高，COL-1A1基因mRNA表达水平降低;伴随软骨细胞去分化，DNMT3A蛋白表达水平升高;经5-AzaC处理后，DNMT3A蛋白表达水平和COL-1A1基因mRNA表达水平降低;miRNA芯片检测发现细胞传代过程中miR-29b下降，5-AzaC上调miR-29b的表达水平;干扰DNMT3A提高miR-29b表达水平，而降低COL-1A1基因mRNA表达水平;并且，过表达miR-29b可抑制DNMT3A和COL-1A1基因表达。 结论:1.本研究建立标准化GMP软骨细胞培养体系，实现了软骨细胞数量级扩增，符合临床应用软骨细胞的安全质量标准，P2代以前的细胞可用于临床ACI治疗。2.DNA甲基化参与调控软骨细胞去分化过程。3.抑制DNA甲基化可延缓或阻止软骨细胞去分化，有利于维持软骨细胞表型。4.5-AzaC主要通过抑制DNMT3A，增强miR-29b对COL-1A1的抑制效应，从而抑制软骨细胞去分化;此外，COL-1A1启动子区域DNA甲基化水平发生变化，抑制COL-1A1的表达水平。