基质重建相关基因7在损伤修复及血管新生中的作用

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第一部分基质重建相关基因7的缺失影响损伤修复  基质重建相关基因7(Mxra7)是2002年Walker和Volkmuth在进行生物信息学分析时发现的。结果显示有8条cDNA总是跟一组与基质重建相关的基因(主要包括Mmps,Timps等)共同表达,于是将这八条cDNA依次命名为Mxra1~8。目前为止,虽然某些成员已被成功克隆并进行了功能研究,但仍没有关于 Mxra7的任何功能性研究报道。  在一个关于小鼠炎性角膜新生血管形成模型的项目中,本课题组采用了全基因组表达谱芯片技术对影响角膜结构和功能的基因进行筛选。在对筛选出的变化基因进行分析时,发现 Mxra7这一基因表达量的变化与角膜新生血管的动态变化具有很好的一致性,并且与 Mmp3、Mmp13等一系列参与角膜损伤修复的基因呈相反的变化趋势,这些结果提示 Mxra7有可能在损伤修复及血管新生的过程中发挥一定的作用。本研究首先采用耳损伤模型初步探讨Mxra7在小鼠耳损伤中的作用。  在 Mxra7对小鼠耳损伤修复中的作用的初步研究中,采用了小鼠耳损伤模型,研究发现Mxra7-/-小鼠比WT小鼠耳洞愈合慢,同时病理切片的结果也验证了上述现象。随后,采用实时定量PCR(Quantitative Real-time PCR,Q-RT-PCR)检测了WT和Mxra7-/-小鼠耳损伤7天后相关基因的表达水平,结果表明在Mxra7-/-小鼠中一些与基质重建相关基因的表达水平要低于WT小鼠。此外,Western blot技术检测两组小鼠在耳损伤修复中一些信号蛋白的磷酸化水平,证实P-SAPK/JNK, P-STAT3, P-STAT5这三种信号蛋白在Mxra7-/-小鼠中的磷酸化水平要低于WT小鼠。  本研究成功构建了小鼠耳损伤模型。通过一系列研究结果表明,Mxra7有可能是通过STAT/JNK信号通路在小鼠耳损伤修复的过程中发挥作用,这为进一步研究损伤修复机制奠定了基础。  第二部分基质重建相关基因7对内皮细胞生物学功能的影响  新生血管是由血管内皮细胞增殖、迁移形成,为研究 Mxra7在新生血管形成过程中可能发挥的作用,探讨了Mxra7对血管内皮细胞SVEC4-10基因表达及细胞生物学功能的影响。首先利用病毒转染技术构建了SVEC4-10-Vector和SVEC4-10-Mxra7稳定转染的细胞株。其次利用Q-RT-PCR技术检测了两株细胞中Mxra7的表达水平,同时还检测了与新生血管相关基因(Acta2、Fgf2、Pdgfa、Col18a1、Vegfa、Vcam-1)的mRNA表达水平。通过CCK-8和细胞周期实验研究Mxra7对SVEC4-10增殖能力的影响。采取细胞划痕实验检测 Mxra7对血管内皮细胞迁移的作用。结果表明,在SVEC4-10细胞中过表达 Mxra7后,与血管新生相关的基因 Acta2、Fgf2、Pdgfa和Vegfa在细胞中的表达水平上升,同时也促进了血管内皮细胞自身的增殖,但是Mxra7过表达后有可能会抑制细胞迁移能力。而Mxra7过表达后对细胞凋亡没有影响。  本研究利用病毒转染技术成功构建了小鼠血管内皮细胞的 Mxra7稳定转染的过表达株,结果显示Mxra7过表达后影响了血管内皮细胞的基因表达水平和生物功能,为进一步研究Mxra7有可能在血管新生过程中发挥的作用奠定了基础。
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