论文部分内容阅读
脂肪酶是一种特殊的酯键水解酶,将脂肪分解为甘油脂和脂肪酸,它广泛存在于动植物和微生物中,也可通过化学合成获得。以动植物作为来源,这些资源受气候、土壤等条件限制,此外动植物种的脂肪酶分离提纯更为复杂,而化学合成法的工艺复杂,且成本又较高,因此大部分酶都是微生物发酵法生产的。目前,产脂肪酶的微生物包括黑曲霉、白地霉、假单胞菌属、毛霉、根霉、假丝酵母等,所产脂肪酶广泛应用于工业中,如洗涤业、食品行业、化学业、皮革业、造纸业等,近年来,脂肪酶在医药业中也受到越来越多的关注。因此,获得高产脂肪酶的菌株在医药业发展中存在巨大的潜在经济价值。本研究从富含脂肪的环境中筛选获得四株产脂肪酶的菌株,分别命名为菌株7、菌株3、菌株6、菌株5,并且通过滴定法对这四株菌株测定其各自的脂肪酶活性分别为3.00U／mL、1.70U／mL、1.70U／mL、4.00U／mL。考察菌株7的培养条件,结果显示菌株7在温度为25℃、pH值为7.0时的条件下,培养时间为72h所产酶的脂肪酶活性最高。通过分子生物学的方法对该菌株的16SrRNA序列的分析,综合其形态特征鉴定该菌株为假单胞菌属,命名为菌株7。在分离纯化脂肪酶之前对该菌株所产的脂肪酶粗品初步确定其等电点以及培养液的盐析范围,结果显示该脂肪酶的等电点约为6.0,硫酸铵饱和度为40%-50%为最佳盐析范围。培养液上清经过分级盐析、脱盐、DEAE-Sepharose Fast Flow层析、冷冻干燥、Sephadex G-75层析的分离纯化方法,SDS-PAGE检测结果显示该脂肪酶的分子量约为31ku。本研究还考察脂肪酶的最适作用条件及其稳定性,结果显示：脂肪酶的最适pH值约为9.0,最适作用温度为40℃。脂肪酶有较宽的pH值和温度稳定范围,在pH值为8.0,温度为30～50℃的条件下更为稳定。在终浓度为1 mmol/L时,Li+、Mg2+、Ba2+等金属离子对脂肪酶活活性有明显的促进作用,吐温80和Triton-100对酶活性起到促进作用,而EDTA对酶活性存在明显的抑制作用；乙酸乙酯对酶活存在抑制作用,但影响较弱,并且表现一定的耐醇性。