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(1).七个种的红豆杉科植物的小茎段外植体,同一植株的不同外植体,在适宜的培养条件下均能诱导出愈伤组织,但诱导率和诱导速度却有差别。七个种的红豆杉科植物的细胞系中,香榧细胞未检测出Taxol,长叶榧细胞中Taxol含量很低,只有0.511μg/g Dw。云南红豆杉、东北红豆杉和中国红豆杉培养细胞的Taxol含量差别不大,但云南红豆杉较易筛选出生长旺盛细胞系,其细胞中的Taxo l最高含量为481.51μg/g DW。
(2).以2,4-D 2.0mg/L为激素较易诱导出愈伤组织,NAA2.0mg/L也具有较高的诱导效果,但诱导过程形成的棕色物质较多,愈伤组织长势不大好,IAA单独使用不能使外植体脱分化形成愈伤组织。
(3).加入2g/L的水解酪蛋白或10mg/L的抗坏血酸能促进愈伤组织的生长,并能明显地减少棕色物质的积累,减轻对细胞的毒害。
(4).经硅胶柱层析和薄层制备,从红豆杉细胞培养物中分离到一结晶,液-质联用仪测其质谱ESI-MS,结合紫外光谱、TLC、HPLC等手段鉴定,证明它为Taxol。
(5).不同的处理方法对Taxol含量有一定的影响。60℃烘干是最适合的采后处理方法,直接提取、冻干后提取、乙醇杀酶后提取,这三种方法的Taxol回收率相差不大,但低于60℃烘干的处理。用乙醇杀酶后于60℃烘干与直接于60℃下烘干相比,后者Taxol含量比前者高28.13%,这表明在烘干过程中,细胞内的酶系参与了Taxol的代谢,促使其它物质转化为Taxol,并且这种转化是在较短时间内完成的。高温(90℃)烘干使Taxol在细胞内发生降解,即使是短暂(20min.)的高温处理也会使Taxol含量下降。
(6).经试验我们找到一套合适的样品预处理及HPLC测定Taxol的方法,按此方法进行测定,Taxol与Cephalomannine及其它杂质能很好地分开,测定效果较好,Taxol有较高的回收率。
(7).培养基中增加(NH<,4>)<,2>SO<,4>100mg/L可使细胞中Taxol含量比对照增加32.92%,增加蔗糖10g/L使Taxol含量比对照降低了将近一倍,降低KNO<,3>浓度至1250mg/L使细胞的Taxol含量增加37.12%,降低CaCl<,2>.2H<,2>O 50mg/L可使Taxol含量增加25.80%。
(8).悬浮培养细胞经4 hr无糖培养的胁迫,再经30d的继续培养,细胞中的Taxol含量比未经胁迫的处理增加了一倍多。
(9).附加0.2mM Gly使Taxol含量比对照增加14.18%,附加1mM Phe使Taxol含量比对照增加236.71%,附加2.0 mg/L的(VO)<,2>(SO<,4>)<,3>使Taxol含量比对照提高49.58%。
(10).对三个种五个细胞系的光照、过氧化物酶活性、Taxol含量以及叶绿素之间的关系进行了研究,得出如下结论:光照对细胞的影响与细胞来源的种无关,而与细胞系的变异有关,来源于同一个植株的不同细胞系,它们对光照的反应也可以不同。凡颜色较浅的细胞系,光照能促进Taxol形成,也使过氧化物酶活性提高,细胞在光照下不出现明显的绿色。对颜色较深的细胞系而言,结果则相反,光照使 Taxol的形成和过氧化物酶活性受抑制,光照使细胞合成叶绿素,而叶绿素的形成对Taxol的积累不利。在光暗处理对比中,Taxol含量变化与过氧化物酶活性变化总是协调一致的。
(11).不同浓度的灰霉.Botritis sp.诱导物,对Taxol的影响有所不同,300mg/L最利于诱导Taxol的形成。不同时期加入灰霉诱导物对 Taxol含量的影响明显不同,以培养的15d(指数生长期)加入诱导物效果最好,使Taxol含量达到对照的14.48倍。
适当浓度的毛霉Mucor sp.、禾谷镰孢Fusarium sp. 、膏霉Penicillium sp. 诱导物能刺激Taxol的形成,产量比对照增加 63.39-105.42%。
(12).加入30mg/L含硒和不含硒螺旋藻多糖都能促进细胞生长,含硒多糖可使Taxol增加228.23%。不含硒多糖使Taxol增加了130.00%。
(13).从细胞培养物中分离、纯化得一白色结晶,经光谱鉴定确定其为豆甾-5-烯-3-醇(Stigmastenol)。在红豆杉细胞培养系统中加入豆甾-5-烯-3-醇的浓度达到20mg/L时,对细胞中的Taxol形成最有利,达到481.51μg/g DW,比对照增加16.4倍。
(14).10L发酵罐培养红豆杉细胞已获得初步成功,细胞培养20d后生物量有所增加,培养细胞和培养液中都检测到Taxol。