论文部分内容阅读
目的:重新建立金钗石斛中石斛碱的HPLC含量测定方法，优化金钗石斛总生物碱和多糖成分的含量测定方法。以降低检验成本，减少毒性化学试剂对环境的影响;采用酶法联合提取金钗石斛生物碱和多糖，提高有关成分的提取率和药材资源的利用率;比较不同提取方法对金钗石斛多糖分子形貌结构的影响，为下一步研究金钗石斛多糖分子高级结构变化对其生物活性的影响提供参考。 方法:1.选用低毒试剂，取代石斛生物碱类成分现行检测方法中使用的三氯甲烷，并重新选择低成本的流动相应用于石斛碱的HPLC定量测定。利用测定生物碱后的同一份金钗石斛药材，进一步开展多糖类成分的定量检测研究。上述建立和优化的含量测定方法均需进行方法学考察;2.应用木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶作为酶法提取金钗石斛有关成分的作用酶，以石斛碱、总生物碱、多糖的定量检测值为评价指标，对影响有关成分提取收率的加酶量、pH值、酶解温度、酶解时间、料液比进行单因素考察。并在此基础上通过正交试验筛选联合提取金钗石斛生物碱和多糖的工艺参数:3.采用原子力显微镜观察的方法，获得金钗石斛多糖分子的形貌结构图像，分析比较不同提取方法对其结构形貌的影响。 结果:1.石斛碱的含量测定中，将药材前处理溶剂由三氯甲烷更换成乙酸乙酯。重新建立的石斛碱的HPLC含量测定方法的色谱条件为:采用C18(5μm4.6×200mm)色谱柱，以甲醇-0.002％三乙胺溶液(47∶53)为流动相，210nm为检测波长，柱温35℃，流速1.0ml·min-1，进样量10μL。石斛碱在0.7228～9.0350μg范围内线性关系良好(r=1)，平均回收率为98.55％，RSD为0.99％;总生物碱含量测定中，将萃取溶剂由三氯甲烷更换成二氯甲烷。经对比与分析，更换萃取溶剂对含量测定结果无影响，方法学考察均符合要求。总生物碱在1.21～6.05μg·mL-1范围内线性关系良好，(r=0.9995)，平均回收率为99.58％，RSD为1.15％;在多糖的含量测定中，可直接采用提取生物碱后的药材样品进行检测，多糖在21.24～84.96μg·ml-1范围内线性关系良好(r=0.9997)，平均回收率为98.52％，RSD为1.48％。表明上述三者的方法学考察均符合要求，且只需称取一份样品即可完成石斛碱、总生物碱、多糖的含量测定。2.采用木瓜蛋白酶提取金钗石斛中石斛碱、总生物碱、多糖的优化提取条件为pH5.5的缓冲液中，加酶量0.10g，酶解温度45℃，酶解时间2h，料液比1∶50(g·mL-1)，与溶剂法相比，三者含量均提高;采用纤维素酶提取金钗石斛中石斛碱、总生物碱、多糖的优化提取条件为pH5.0的缓冲液中，加酶量0.30g，酶解温度50℃，酶解时间2h，料液比1∶40(g·mL-1)，与溶剂法相比，三者含量均提高;采用果胶酶提取金钗石斛中石斛碱、总生物碱、多糖的优化提取条件为pH4.5的缓冲液中，加酶量0.45g，酶解温度55℃，酶解时间2.5h，料液比1∶40（g·mL-1），石斛碱、总生物碱含量提高，多糖含量未能提高。3.在扫描探针显微镜下观察多糖的结构，发现金钗石斛多糖系由大分子链相互连接而形成的结构复杂的网状结构。但木瓜蛋白酶、纤维素酶、果胶酶酶解反应液经氨水碱化提取生物碱后，再提取的多糖其大部分网状结构的分子链被改变，由复杂的网状结构裂解成为简单的分枝碎片结构。其他提取方法得到的多糖其形貌结构均无太大差异。经对金钗石斛多糖的大分子链进一步放大观察发现:这些大分子链系由球状聚合体结合成“串珠链”，并由串珠链相互缠绕成螺旋状的聚集体而形成。 结论:1.重新建立的石斛碱含量测定方法、优化后的石斛总生物碱和多糖的含量测定方法可行。应用上述检验方法可降低样品前处理和检测试剂的毒性，减少药材用量。有利于环保和节约检验成本。2.木瓜蛋白酶、纤维素酶法可提高金钗石斛中石斛碱、总生物碱、多糖的提取量，两者提取效果相当;果胶酶法可提高金钗石斛中的石斛碱、总生物碱成分的提取量。3.初步探讨了提取方法对金钗石斛多糖高级结构的影响，可为进一步研究金钗石斛多糖分子高级结构变化对其生物活性的影响提供参考。