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背景与目的
人胰腺癌是一种预后极差的高度恶性肿瘤。其发病率和死亡率之比为 1：0.99。
五年生存率<5％，两年生存率仅为20％。往往在初次就诊时，80％的患者只能接受姑息性治疗，而剩余20％的患者即便能够接受手术治疗，术后仍出现较高复发率。在胰腺癌中，源于导管上皮细胞胰腺导管腺癌（PDAC）最多见，占胰腺肿瘤的85％-90％。
促纤维结缔组织增生是PDAC的一个显著的病理学特征。在所有上皮细胞恶性肿瘤中，PDAC促纤维结缔组织增生的改变远比其它肿瘤更为明显。研究表明，促结缔组织增生在肿瘤发生、发展、转归及耐药等方面都起到至关重要的作用。有学者报道大量肿瘤相关成纤维细胞（Tumor-associated fibroblasts, TAFs）的存在和促结缔组织增生关系密切，TAFs可以通过表达各种细胞因子和蛋白等方式来影响肿瘤间质的形成和变化，而成纤维细胞激活蛋白（fibroblast activation protein-α, FAP-α）就是TAFs所表达的一种标志性的蛋白。近年来，随着肿瘤学和分子生物学的发展，分子靶向治疗已经成为了肿瘤治疗的热点和主要发展方向，而这种治疗主要就是以肿瘤的分子靶位作为基础，因此寻找理想的分子靶标是靶向治疗的关键因素。TAFs被认为是肿瘤间质中最具潜力的靶标之一。
FAP-α是一种膜结合糖蛋白，属于丝氨酸蛋白酶类，由两个亚单位组成分子量为170kDa的二聚体，具有分解明胶和I型胶原的活性以及类似二肽肽酶的活性，能够降解许多二肽和I型胶原。这种蛋白分解活性可见于原发性人上皮性肿瘤中，因此FAP-α
在肿瘤间质的形成、再塑和维持上可能起重要作用。研究表明，伴少量FAP-α表达的间质反应使乳腺癌侵袭性更强。基质降解是癌细胞侵袭和转移的主要机制之一。
FAP-α作为丝氨酸蛋白酶，在肿瘤组织中很有可能直接溶解与其相邻的细胞外基质或者激活另外一种蛋白酶原而间接溶解细胞外基质，促进癌细胞的侵袭。FAP-α能够选择性的高表达于多种上皮组织来源恶性肿瘤间质中的的肿瘤相关成纤维细胞（TAFs），却几乎不表达于正常组织及良性上皮肿瘤间质中静息成纤维细胞，且罕见于肿瘤细胞中。90％以上的上皮性肿瘤(肺、大肠、乳腺癌的原发和转移瘤)中间质FAP-α呈阳性。FAP-α阳性间质成分通常占肿瘤组织的50％～90％，是丰富的靶目标结构。FAP-α主要表达于间质TAFs中，而TAFs是结缔组织增生的最重要因素之一。这些都提示FAP-α是一种理想的肿瘤间质靶标。由于一些正常的胰岛A细胞被发现偶尔也可以表达FAP-α，那么胰腺癌细胞会不会也表达FAP-α；如果表达，那么它会对肿瘤细胞在体内和体外产生什么样的作用，其作用会不会和TAFs中的FAP-α产生叠加效应，对未来针对FAP-α的靶向治疗有什么意义，这些都非常值得研究。同时，有证据提示PAP可通过促进胰腺癌纤维结缔组织增生来促进肿瘤的生长和转移的。所以本文通过研究胰腺癌组织中FAP-α对胰腺癌包括促纤维结缔组织增生在内的生物行为学的影响。
方法
（1）PDAC 标本；选取PDAC 存档石蜡包埋标本共198例（组织芯片105例，常规切片93例），所有病例均经病理证实，且术前无放、化疗史。患者的基本信息包括就诊原因、既往史、术前有无接受治疗、手术时间、肿瘤部位、术中判断血管浸润情况、病理巨检以及镜检结果等临床病理资料；对其中139例病例进行随访，时限为33个月，99例接受随访，40例失访。所有病例均经长海医院伦理道德委员会批准。
对93例PDAC 常规HE 染色切片，观察肿瘤组织内纤维化灶（fibrotic focus，FF）。
显微镜下观察在细胞内出现棕黄色颗粒为FAP-α阳性。结合文献对PDAC中癌细胞FAP-α的表达采用二级计分法,分别对染色强度及阳性细胞数量计分。同时采用Western blotting 检测FAP-α蛋白在6株PDAC细胞株（Miapaca-2、 AsPC-1、SW1990、BxPC-3、Panc-1及Capan-1）中的表达。选择FAP-α低表达的细胞株用于后续试验。
（2）FAP-α过表达慢病毒载体构建和感染：成功构建了FAP-α过表达的慢病毒载体FAP-GFP-LV，并用其感染AsPC-1细胞株，并设立阴性对照（PGC-FU）、处理组（感染慢病毒Pgc-FU-FAP-α）和空白对照组，对三组细胞进行细胞功能实验，包括克隆形成，流式细胞仪测定细胞周期，MTT 法研究细胞生长情况。（3）裸鼠成瘤实验：
18只4-6周龄雄性裸鼠均分为3组：空白对照组、阴性对照组和处理组。每只小鼠皮下注射0.2ml的浓度为5×106/ml的各组AsPC-1细胞。观察肿瘤生长速度，30天后取皮下肿瘤进行HE 染色，FAP-α免疫组化染色，和Van Gieson 胶原纤维染色，并观察各组肿瘤组织中结缔组织增生情况和纤维化灶的状况。
结果
198例PDAC中，FAP-α在癌旁正常导管上皮中几乎不表达，在癌组织中阳性表达率为74.2％，表达定位有细胞膜和细胞浆、细胞浆以及少部分病例中的细胞浆内近腔缘处。其表达形式可见弥漫表达或灶性表达。FAP-α在癌内成纤维细胞中表达阳性率为70.2％（139/198），定位于细胞浆或细胞膜，分布多紧邻于肿瘤组织，而在癌旁远离肿瘤组织的区域则少有分布。93例PDAC中，70（75.3％）例出现纤维化灶，相比于癌旁较为规整的排列。FAP-α在PDAC 癌组织中的表达与患者年龄、肿瘤大小、FF 以及神经浸润有关，与其它临床病理参数无关。Kaplan-Meier分析以及Log-rank检验结果显示，FAP-α阳性患者的平均生存期和中位生存期均显著低于FAP-α阴性患者。Cox 回归模型分析对影响PDAC 预后的独立因素包括FAP-α在癌组织中的表达，肿瘤分化程度及神经浸润。Western Blotting 检测结果显示，FAP-α在6株胰腺癌细胞株中均有表达，表达程度强弱不等, 灰度分析结果显示，在Capan-1和Panc-1细胞株表达较高，AsPC-1细胞株中较低， AsPC-1被选择用于过表达实验。经过验证我们成功构建FAP-α过表达慢病毒载体，其包装滴度为：2E+8 TU/ml。感染后MTT 实验、克隆形成实验，和流式细胞术检测发现，FAP-α过表达对于AsPCA-1细胞的细胞周期分布、克隆形成能力和生长情况没有明显影响。体内试验结果显示处理组肿瘤生长速度显著快于其他两组，且30天时肿瘤体积显著大于其余两组。免疫组化结果发现FAP-α在三组成瘤组织中均有表达，在Pgc-FU-FAP-α组成瘤组织中表达最强。Van Gieson 胶原纤维染色发现处理组肿瘤组织中红色胶原纤维明显对于其他两组。
结论
本研究首先检测到了FAP-α蛋白在人胰腺癌组织细胞标本中表达和定位，这和以往认为FAP-α主要表达于肿瘤间质的成纤维细胞而罕见于肿瘤细胞本身完全不同。
同时还发现FAP-α蛋白也表达于本研究的所用的6株胰腺癌细胞株：AsPC-1、SW1990、BxPC-3、Miapaca-2、Capan-1和Panc-1。其中在Capan-1和Panc-1细胞株中表达较高，在AsPC-1表达较低。MTT 检测，流式细胞术和克隆形成实验结果显示FAP-α过表达对AsPC-1细胞的生物学行为无显著影响，而体内试验显示，FAP-α可以促进肿瘤的生长和结缔组织增生，提示FAP-α可能只能在体内通过影响肿瘤间质施加对肿瘤生长的作用。未来的研究还需要进一步明确FAP-α影响肿瘤生长的具体机制，以及表达于胰腺癌细胞本身和间质TAFs中的FAP-α是否具有叠加功能。对这些问题的回答将为未来靶向FAP-α的肿瘤治疗提供有价值的依据和信息。