基于核酸适体末端原位标记信号分子的高灵敏电化学传感器

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基于核酸适体的电化学生物传感器是目前电化学分析领域的研究热点,其具有更好的制备简单、选择性好、灵敏度高及易于微型化等优点,在食品安全、环境检测、转基因测定、法医鉴定、医药工业等领域具有广泛的应用前景。但核酸适体传感器在检测过程中的信号转化一直是决定该类传感器制备和性能的关键。本论文通过在核酸适体生物界面上原位标记具有电化学活性分子物质的方法,构建了三种基于DNA生物识别元件的标记型电化学传感器,具体研究内容如下:  (1)根据普鲁士蓝(PB)自身良好的氧化还原性以及铅适配体对铅离子(Pb2+)特定的结合选择性,构建了一种基于核酸适体自由末端标记纳米金(AuNPs)和现场生成PB的新型铅电化学传感器。首先将与铅适配体链部分互补的探针链和5末端修饰有-SH的铅适配体链分别通过自组装和杂交反应用固定在金电极表面,然后将AuNPs通过Au-S键修饰在适配体末端,并利用纳米金对PB的催化生成作用,在AuNPs表面现场生成PB,得到了以PB为电活性信号源和AuNPs为电催化剂的铅电化学传感器。当Pb2+存在时,适配体连同组装的AuNPs-PB与Pb2+形成G-四联体结构,从修饰电极表面脱落,从而使信号降低。采用循环伏安法、电化学交流阻抗法对修饰电极层层组装过程进行表征,并且对修饰电极的层层组装及分析测试条件进行了实验优化。在最佳条件下,该传感器电化学信号与Pb2+浓度对数在1.0×10-13~1.0×10-8mol/L的铅浓度范围内,具有良好的线性关系,其检出限可达1.8×10-14mol/L。同时,该传感器显示了良好的选择性和再生性。  (2)在凝血酶适配体链末端组装AuNPs和L-半胱氨酸(L-Cys),再以半胱氨酸配位铜离子(Cu2+),得到以Cu2+为信号源的凝血酶电化学传感器。首先将一段5末端修饰-SH的与凝血酶适配体互补的探针链通过Au-S键自组装到金电极表面,然后以杂交的方式将凝血酶适配体链固定到电极表面,再以稳定的Au-S键自组装AuNPs和L-Cys到修饰电极表面,之后利用L-Cys的氨基、羧基与Cu2+配位的原理,将Cu2+固定于AuNPs的表面从而得到了一种以Cu2+/L-Cys/AuNPs为信号的高灵敏凝血酶电化学传感器。实验结果表明,该传感器能在1.0×10-13~2.0×10-6mol/L浓度范围内能对凝血酶进行定量检测,检出限达21fmol/L。  (3)在两种适配体链末端分别修饰了不同的官能团醛基(-CHO)和羧基(-COOH),然后在两官能团上分别原位标记了Cu2+和耐尔兰(NB)作为信号源,得到了一种新型的双适配体电化学传感器。首先将末端修饰有-CHO的Pb2+适配体链和末端修饰-COOH的Hg2+适配体链同时以Au-S键固定于金电极表面,然后利用-CHO与三聚氰胺(Mel)的共价作用,将Mel修饰到铅适配体链末端,并以Mel来配位Cu2+,达到修饰Cu2+信号源的目的。将Hg2+适配体末端的-COOH进行活化,然后共价键合上电活性分子NB,从而得到了双适配体标记型电化学传感器。利用富G碱基适配体对Pb2+及富T碱基适配体对Hg2+的特异性识别,实现了该传感器对双金属离子的同时检测。在最佳条件下,传感器在Pb2+和Hg2+的线性检测范围分别为1.0×10-12~5.0×10-8mol/L和1.0×10-10~2.0×10-7mol/L的浓度内实现定量检测,其检出限分别为0.979pmol/L和19.7pmol/L。实验表明,传感器可用于实际水样中Pb2+和Hg2+的同时检测,结果满意。
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