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BMPs可促进成牙本质细胞分化和第三期牙本质的形成，在牙髓的损伤修复中发挥重要调控作用。BMPs生物学效应的分子机制涉及两条重要的信号通路：Smads蛋白依赖性和Smads蛋白非依赖性信号转导途径。Smads蛋白依赖性信号转导途径由靶细胞膜上BMP受体及细胞质内各型Smads蛋白协同参与完成，是TGF-β超家族包括BMPs信号转导的经典通路。BMPs与细胞膜上相应受体结合后使BMP-Smad通路上游信号分子R-Smad磷酸化，磷酸化的R-Smad与Smad4结合，形成Smad复合体后转入核内，在核内蓄积引起靶基因的转录并引发下游信号转导。本课题组前期研究证实，重组腺病毒介导的BMP-7基因转染人牙髓细胞可诱导碱性磷酸酶活性的增强，能促进人牙髓细胞的成牙本质细胞向分化。但大量Smad复合物的积聚可引起基因转录的过度活化导致细胞表达产物的改变，因此Smads蛋白的降解对BMP-Smad通路的调控至关重要。泛素-蛋白水解酶复合体通路可通过调节Smad蛋白降解有效调控TGF-β家族信号转导，而E3泛素连接酶Smurf1作为该通路的核心因子，在参与调控BMP-Smad信号通路中发挥重要作用。但Smurf1参与Smad信号转导的调控机制对BMP-7诱导人牙髓细胞分化的影响，目前尚不清楚。因此，本实验将带有绿色荧光蛋白基因的腺病毒载体转染人牙髓细胞，确定重组腺病毒转染人牙髓细胞的最适MOI值；通过构建携带有目的基因Smurf1的重组腺病毒载体转染人牙髓细胞，检测rAd-Smurf1转染人牙髓细胞后碱性磷酸酶活性以及牙本质涎磷蛋白mRNA表达，阐明rAd-Smurf1转染对BMP-7诱导人牙髓细胞分化的影响；通过对分子机制的研究，进一步探讨Smurf1基因转染人牙髓细胞对BMP信号蛋白Smad1，Smad5的调节作用，从分子水平探讨Smurf1对BMP-7诱导人牙髓细胞分化的调控机制，为深入研究BMP-Smad信号转导机制，增强BMP-7对人牙髓细胞的促分化作用提供实验依据和理论基础。
目的：
通过rAd-Smurf1转染人牙髓细胞构建Smurf1稳定表达的体外细胞模型，检测BMP-7诱导前后胞内ALP活性以及DSPPmRNA的表达，观察Smurf1对BMP-7诱导人牙髓细胞向成牙本质细胞分化的影响；检测Smad1，Smad5蛋白的表达，从分子水平进一步观察Smurf1基因转染人牙髓细胞对BMP信号蛋白Smad1，Smad5的调节作用，探讨Smurf1对BMP-7诱导人牙髓细胞分化的调控机制，为深入研究BMP-7促人牙髓细胞分化的调控机制，增强BMP-7对人牙髓细胞的促分化作用提供实验依据和理论基础。
研究方法：
①采用Ⅰ型胶原酶消化组织块法培养hDPCs并鉴定组织来源。
②将rAd-EGFP、按感染复数(multipleofinfection，MOI)75、100、200转染hDPCs48h后免疫荧光显微镜观察各组绿色荧光蛋白表达情况，确定Ad转染hDPCs的最适MOI值；流式细胞仪检测转染后7drAd-EGFP对hDPCs的转染效率；MTT法检测rAd-EGFP按最适MOI值转染hDPCs4d、6d、8d、10d、12d后增殖活性。
③构建rAd-Smurf1载体；Westernblot检测rAd-Smurf1转染48h后hDPCs中Smurf1蛋白的表达。
④rAd-Smurf1转染hDPCs后检测rhBMP-7诱导前后对ALP活性及SPPmRNA的表达量，观察rAd-Smurf1转染后hDPCs分化的生物学特性。
⑤rAd-Smurf1转染hDPCs后Westernblot检测rhBMP-7诱导前后胞内Smad1，Smad5蛋白的表达。
结果：
①本研究采用Ⅰ型胶原酶消化组织块法可有效进行hDPCs的原代培养。MTT结果显示细胞具有较强的增殖活性；细胞来源鉴定结果显示，所获得的细胞均为抗波形丝蛋白染色阳性，抗角蛋白染色阴性。
②rAd-EGFP转染hDPCs后24h可见荧光表达，EGFP的表达数随着MOI值的增加而增高；48h荧光显微镜下观察，当MOI值为75，100，200时转染率分别为(84.79±1.14)％，(90.46±0.91)％，(95.8±1.48)％；按MOI值为100转染hDPCs7d后流式细胞仪检测rAd-EGFP转染率为90.3％；MTT结果显示转染后转染组与未转染组在各时间点吸光度值差异无统计学意义(P＞0.05)。
③成功构建rAd-Smurf1；Westernblot结果显示rAd-Smurf1转染hDPCs后能成功表达Smurf1。
④rAd-Smurf1转染hDPCs在200ng/mlrhBMP-7作用10d后与对照组比较，ALP活性检测结果显示ALP活性降低，差异具有统计学意义(P＜0.01)；Real-timePCR结果显示DSPPmRNA的表达量下调，差异具有统计学意义(P＜0.01)，结果表明rAd-Smurf1在rhBMP-7诱导hDPCs分化过程中发挥负性调节作用。
⑤rAd-Smurf1转染hDPCs在200ng/mlrhBMP-7作用48h后，Westernblot免疫印记结果显示Smad1，Smad5蛋白表达较对照组有明显减少。
结论：
rAd-Smurf1转染hDPCs可获高效稳定表达；rAd-Smurf1转染hDPCs降低碱性磷酸酶表达活性及减少DSPPmRNA的表达量，对hDPCs的分化指标具有调控作用；从分子水平进一步探讨Smurf1参与调控hDPCs内BMP/Smad信号的分子机制，rAd-Smurf1转染hDPCs后胞内Smad1，Smad5蛋白表达量减少，提示Smurf1在rhBMP-7诱导hDPCs分化过程中发挥负性调节作用。以上研究为进一步探讨Smurf1对BMP-7诱导hDPCs分化的调控机制，深入研究BMP-Smad信号转导机制，增强BMP-7对hDPCs的促分化作用提供实验依据和理论基础。