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基因芯片作为一种高端的生物信息学技术,在分子生物学、基因组学、蛋白组学等方面发挥着巨大的作用,该技术自1995年问世以来,就广泛应用于基因表达谱分析、新基因的发掘、功能基因组研究等领域。
本研究在实验室已经构建好的粳稻云引受稻瘟病诱导表达的基因芯片的基础上,主要得到以下结果:
(1)以粳稻云引和其离子束诱变材料4048(稻瘟病感病)为实验材料,选择基因表达芯片中对稻瘟病菌诱导作出响应的显著相关的候选基因CB652033和AK065873进行克隆,并通过RACE技术得到了EST CB652033的cDNA全长。
(2)测序表明,云引和4048中CB652033的同源性为95.6[%],但有几个碱基的缺失,而AK065873在云引和4048之间的差异甚大,其同源性仅为87.3[%],诱变材料中缺失一段长达102bp的序列,预测该基因可能是云引抗病而4048感病的一个原因。
(3)通过对NCBI中GeneBank检索发现,CB652033与磷酸核酮糖激酶和磷酸戊糖激酶的活性相关,这两种酶在糖代谢中起到重要的作用,因而推测此基因可能参与磷酸核酮糖和磷酸戊糖的代谢活动。AK065873为一种bzip转录因子,其功能与ABI5类似。
(4)通过与NCBI中GeneBank比对,下载比对序列,运用MEGA4构建了两基因的遗传进化树。结果发现,CB652033在水稻中有5个同源性近90[%]的序列,而与NM-001054360的同源性达到99[%],推测其就是NM-001054360的一个EST。AK065873与水稻中ABI5的编码基因NM-001069897的同源性达到95.89[%],与玉米中编码ABI5的基因EU961169的同源性有84.35[%],与小麦中编码ABI5的AY150675的同源性达到85.42[%]。
(5)荧光定量PCR表明,CB652033在接种12h时表达最上调,随着时间的推移又逐渐下调,与基因表达芯片数据大致吻合,说明该基因在遇到病原菌侵袭时起到了一定的防御作用,而后续的表达下调则可能是该基因的防御不足以抵挡病害的侵袭,因此一直受到抑制。AK065873基因在稻瘟病菌接种12h时表达最上调,随后随着时间的推移,一直下调表达,直到96h时又上调表达,结合bzip转录因子的特性及其表达特性,推测该基因在病虫害侵袭时会产生抗性反应,在病害侵袭方面有一定的抵抗功能。
(6)以pBI121为空载体,分别在扩增两个基因的引物两端加入酶切位点,构建了该两个基因的植物高效表达载体,进行烟草的转化。