高羊茅高频再生体系的建立和基因枪法介导的遗传转化研究;高羊茅几丁质酶基因Ⅰ保守片段的克隆及其序列分析

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高羊茅(Festucaarundinacea),又称苇状羊茅,系禾本科(Gramineae)羊茅属植物,原产西欧、北非,它具有抗旱、耐瘠薄、适应性广等特点,在城市绿化及运动场草坪铺设中应用十分广泛。但由于它也存在叶片粗糙、没有匍匐茎、夏季生长缓慢、易遭病原体和杂草侵害等品质上的缺陷,因而需要对其进行品种改良。通过转基因技术培育出具有优良抗逆性状且美观的高羊茅品系近年来备受人们的重视。 植物遗传转化的先决条件是高频再生体系的建立,故本研究首先以高羊茅成熟种子为外植体、以MS为基本培养基,研究了高羊茅胚性愈伤组织诱导和继代、再生植株分化和生根等培养基中各组分的最适配比,建立了高频再生体系。实验结果表明在附加9mg/L2,4-D的MS培养基上愈伤组织诱导频率最高,初生愈伤组织在含有5mg/L2,4-D、400mg/LCH、60g/L蔗糖和12g/L琼脂的MS继代培养基上可诱导出胚性愈伤组织和体细胞胚,在含2.0mg/L6-BA和0.5mg/LNAA的MS培养基上分化形成丛生苗,分化频率达到78.9%。再生苗在1/2MS+NAA0.5mg/L生根培养基上生根率达100%。同时发现在继代培养基中将蔗糖和琼脂浓度提高、以及添加一定量的CH从而形成一个高渗环境能明显提高胚性愈伤组织的质量和诱导频率,十分有利于后期的分化,这是高羊茅高频再生体系形成的一个非常关键的因素。 基因枪技术是禾本科植物遗传转化的常用方法,本工作利用PDS1000/He基因枪将质粒pARN6(克隆有水稻几丁质酶基因RC24)和质粒pD(克隆有β-葡糖醛酸糖苷酶基因gus和选择标记基因bar)导入高渗处理6h左右的高羊茅胚性愈伤组织,在分别附加2.0mg/L、3.0mg/L、5.0mg/L除草剂PPT(草丁膦)的分化培养基上对轰击材料进行梯度筛选和培养,结果在附加2.0mg/L的PPT培养基上愈伤组织基本上全部生长正常;在附加5.0mg/LPPT的培养基上,愈伤组织几乎全部死亡;而在附加3.0mg/LPPT的培养基上,大部分愈伤组织逐渐变为褐色而死亡,少部分能正常生长。由此可见,采用3mg/L的PPT筛选浓度较为合适。经筛选再生后共获得93株再生植株,用含有0.2%Tween-20的200mg/LPPT溶液对植株叶片进行喷洒,最终从93株再生植株中筛选出两株叶片始终未枯萎的再生苗,经PCR鉴定初步确定为转化植株。 另外本工作根据几种采本科植物Ⅰ类几丁质酶氨基酸序列及其基因核苷酸序列的同源性比对结果设计出一对简并引物(P1:5-TGCCCCAACTGCCTCTGCT-3、P2:5-CCTCTGG(T/C)TGTAGCAGTC(C/G)A-3),通过PCR反应克隆了两条高羊茅几丁质酶基因片段。用0.2%氯化汞溶液处理幼嫩叶片24h,提取总RNA,同时从新鲜幼嫩叶片中提取总DNA,以二者为模板分别进行RT-PCR和PCR反应,扩增后得到两个长度各为849bp和843bp的DNA片段,分别命名为fescue-1及fescue-2;经六框翻译后推导出两个连续完整的氨基酸序列,分别命名为gym-pro-1及gym-pro-2。使用Megalign软件进行比对,发现这两个推导出的氨基酸序列相似性达到99%,两个核苷酸序列相似性达到97%。在NCBI网站上进行BLAST搜索,结果表明它们的核苷酸序列和氨基酸序列分别和其它采本科植物的Ⅰ类几丁质酶基因序列和氨基酸序列有较高的同源性,其中,gym-pro-1与早熟禾、大麦及黑麦Ⅰ类几丁质酶的氨基酸序列相似性分别高达85%、87%和84%。 同源性比对结果显示,两条扩增片段在序列上具有微小差异,这表明fescue-1与fescue-2并非来自于同一个基因,即RT-PCR中扩增产生fescue-2的mRNA并不是PCR中扩增产生fescue-1的模板DNA的转录产物。本工作实验结果显示在高羊茅中可能存在一个Ⅰ类几丁质酶多基因家族,它们在核苷酸序列和氨基酸序列上具有高度的同源性。
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