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草酸氧化酶(EC1.2.3.4，Oxalate oxidase，OxO)催化草酸氧生成CO2和H2O。生物信息学分析表明，水稻中编码OxO的基因有4个，在3号染色体上以串联的形式排列，其编码的氨基酸序列相似性在90％以上，但不同OsOxO在水稻中的生理功能却有很大差异。本研究以过量表达OsOxO1和Os OxO4拘转基因水稻叶片为材料，分离纯化了OsOxO1和OsOxO4，并对其生化特性和活性中心的必需氨基酸进行了分析，旨在探讨OsOxO1和OsOxO4生理功能存在差异的原因，获得的主要结果如下： 1.OsOxO1和OsOxO4的分离纯化及分子量 利用60℃热变性和ConA-Sepharose亲和层析分别从过量表达Os OxO1和Os OxO4的水稻叶片中纯化了OsOxO1和OsOxO4。其中OsOxO1被纯化了146倍，活力回收为23%；OsOxO4被纯化了81倍，活力回收为21%。SDS-PAGE分析表明经上述方法纯化得到的两种酶的纯度已达到95%以上。此外，由SDS-PAGE图谱可知OsOxO1和OsOxO4亚基的分子量分别为25kDa和30kDa。CN-PAGE结果表明OsOxO1全酶的分子量为242kDa，OsOxO4的为318kDa，因此推测OsOxO1和OsOxO4均为十聚体。糖蛋白染色结果显示OsOxO1和OsOxO4均为糖蛋白。 2.OsOxO1和OsOxO4的生化特性 OsOxO1和OsOxO4的最适pH皆为3.5，随着pH的增加，OxO活性迅速下降。OsOxO1和OsOxO4的活性均受草酸抑制，当草酸浓度大于0.3 mmol/L时，OsOxO1的活性受到抑制；大于0.5 mmol/L时，OsOxO4的活性受到抑制。OsOxO1对底物草酸的Km值是0.92 mmol/L，Kcat为4.25 S-1；而OsOxO4对草酸的Km值为0.38 mmol/L，Kcat为6.29 S-1，说明OsOxO4与草酸的亲和力强于OsOxO1与草酸的，但二者的催化效率皆较低。OsOxO1和OsOxO4的热稳定性皆很高，尤其是OsOxO1，在90℃加热1h仍能维持全部活性。此外，OsOxO1和OsOxO4都耐胃蛋白酶，但不耐SDS。 3.OsOxO1和OsOxO4的抑制剂和激活剂 1 mmol/L NO3-对OsOxO1和OsOxO4活性都具有很强的抑制作用；Cl-对OsOxO1的活性有一定的抑制作用，对OsOxO4的活性则无影响；SO42-对OsOxO1和OsOxO4活性都有较强的抑制作用，且对OsOxO1活性的抑制作用强于OsOxO4；CO32-对OsOxO1有轻微的激活作用，但对OsOxO4活性无影响；EDTA对OsOxO1和OsOxO4的活性都有轻微的激活作用；1 mmol/LCa2+可使OsOxO1和OsOxO4活性提高50%；果糖-6-磷酸、果糖-1，6-二磷酸、葡糖糖-6-磷酸和甘露糖-6-磷酸皆可使OsOxO1和OsOxO4的活性明显提高，尤其是果糖-6-磷酸可以使OsOxO1和OsOxO4的酶活分别提高3.4倍和2.5倍。而甘露糖、甘露醇、葡萄糖和果糖对OsOxO1和OsOxO4的活性却无显著的影响。Accelrys Discovery Studio软件预测除甲酸外，其它与草酸结构类似的有机酸与OsOxO1和OsOxO4的结合能力均大于草酸，其中乙醇酸、乙醛酸、草酰乙酸、苹果酸、柠檬酸、丙酮酸均可抑制OsOxO1和OsOxO4的活性，尤其是草酰乙酸。其中，乙醛酸和乙醇酸是OsOxO4催化草酸降解的竞争性抑制剂，Ki分别是12.7±3.1(mmol/L)和6.0±2.2(mmol/L)；是OsOxO1催化草酸降解的非竞争性抑制剂。 4.OsOxO1和OsOxO4活性的必需氨基酸 Accelrys Discovery Studio软件预测表明OsOxO1与草酸作用的氨基酸主要有Phe35、Leu36、Trp64、Gly66、Val67、Leu70和Val72；OsOxO4与草酸作用的主要氨基酸除了Phe35、Gly66、Val67和Leu70外，还会与Phe9、Thr69、Asp8、Cys10、Val11、Ala12，Pro65和Ash68发生作用。采用2，3-丁二酮、DTNB、NBS、DEPC和EDAC5种化学修饰剂对OsOxO1和OsOxO4进行修饰，结果表明：2，3-丁二酮对OsOxO1和OsOxO4的活性没有影响，说明精氨酸与二者的活性无直接关系；0.5、1.0和2.0 mmol/L的DTNB也未使OsOxO1和OsOxO4的活性受到明显影响，所以巯基可能不是OsOxO1和OsOxO4活性的必需基团；碱性条件下的NBS对OsOxO1和OsOxO4的活性都也无影响，说明酪氨酸与酶活性无直接关系；酸性条件下NBS对OsOxO1和OsOxO4的酶活都有很强的抑制作用，邹氏作图法表明二者活性中心皆存在一个必需的色氨酸残基，而且荧光色谱分析的结果也表明色氨酸在酶的催化方面具有重要作用。因此色氨酸是OsOxO1和OsOxO4活性的必须氨基酸。DEPC和EDAC对OsOxO4的活性皆有很强的抑制作用，而对OsOxO1酶活的影响稍弱些，这主要是因二者氨基酸序列上的差异引起的，但仍可说明组氨酸对OsOxO1和OsOxO4活性的维持有一定的作用，OsOxO4的51位组氨酸、86位和91位的谷氨酸对其活性的维持具有重要的作用。