【摘 要】
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嗜肺军团菌是引起人类军团菌肺炎的主要病原体,而SdeA是其重要的效应子。SdeA是新发现的一种不依赖于E1、E2酶的新型泛素化蛋白,仅一个蛋白即可催化完成泛素化,整个过程分为两步:首先SdeA的mART结构域将NAD+上的ADP核糖基团连接到泛素第42位的精氨酸上,生成ADP核糖基化的泛素(ADPr-Ub);然后,PDE结构域切割ADPr-Ub中的磷酸二酯键,生成磷酸核糖基化的泛素(Pr-Ub)。
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嗜肺军团菌是引起人类军团菌肺炎的主要病原体，而SdeA是其重要的效应子。SdeA是新发现的一种不依赖于E1、E2酶的新型泛素化蛋白，仅一个蛋白即可催化完成泛素化，整个过程分为两步:首先SdeA的mART结构域将NAD+上的ADP核糖基团连接到泛素第42位的精氨酸上，生成ADP核糖基化的泛素（ADPr-Ub）;然后，PDE结构域切割ADPr-Ub中的磷酸二酯键，生成磷酸核糖基化的泛素(Pr-Ub)。 本文根据实验室解析的SdeA和SdeA-Ub结构，设计了几个关键氨基酸的突变体蛋白，通过体外泛素化（考马斯染色、磷酸化染色、质谱分析）、酵母毒性实验等成功验证了结构的准确性。同时又通过soaking的方式，成功解析了SdeA-Ub-NADH复合物的结构，同样对几个结合NADH的关键氨基酸进行突变，通过体外泛素化、酵母毒性实验和微量热泳动(MST)实验等验证了结构的准确性。同时也验证了SdeA各结构域的功能，证明了DUB具有去泛素化功能，PDE可以单独发挥活性，但是mART的活性需要PDE辅助，以及CTD可以结合T4SS中的IcmS等蛋白等。 此外，本文还研究了针对SdeA的最近发现的新型去泛素化酶SidJ，构建了多个重组子并表达纯化，最终选择了SidJ95-856和SidJ125-873这两个蛋白完成了实验室2544个池液条件的筛选。同时，通过孵育、共表达等方法获得了SdeA1191-1350+IcmS+IcmW+DotL四元复合物蛋白，完成晶体初筛后得到了两个可以生长晶体的条件并对其进行了优化。
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