论文部分内容阅读
研究背景:多囊卵巢综合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)是育龄期女性常见的内分泌和代谢紊乱性疾病之一,其内分泌及代谢系统的异常往往表现为损害女性生殖健康甚至造成不孕。此类患者其卵巢中卵泡刺激素(Follicle Stimulating Hormone,FSH)的作用受到阻滞,最终导致卵泡异常闭锁,不排卵。BMAL1(Brain and muscle ARNT-like protein 1)被认为在哺乳动物生殖系统卵巢的卵泡发育和激素合成中起到重要作用,对于维持哺乳动物生殖功能有着重要的功能。SIRT1(Sirtuin1)在维持哺乳动物卵泡发育过程正常进行中起到重要作用,并通过与BMAL1相互作用而呈现节律性表现。研究显示,其在颗粒细胞等雌激素合成细胞中对芳香化酶的表达调控起到重要作用。然而,BMAL1在PCOS患者卵巢颗粒细胞中表达与正常人群是否存在差异,人的颗粒细胞中BMAL1是否参与同时如何调控雌激素合成,SIRT1在此过程中扮演着什么样的角色仍是不明确的。我们的实验旨在研究BMAL1是否与PCOS的发生发展存在联系,BMAL1是否并且如何在人颗粒细胞中对雌激素合成起到调控作用。方法:1.人卵巢颗粒细胞BMAL1与PCOS相关性研究:我们纳入了2014年9月-2015年9月在仁济医院生殖中心IVF/ICSI-ET予长方案促排卵,以hCG为扳机方式的PCOS患者及非PCOS患者各24例,检测记录了包括年龄、BMI、空腹血糖、hCG用量等临床指标,收集其卵巢卵泡液样本并进行颗粒细胞提取,通过qRT-PCR检测两组人群颗粒细胞中BMAL1mRNA的水平。2.BMAL1在人卵巢颗粒细胞中对雌激素合成的具体调控机制的研究:利用人原代颗粒细胞及人卵巢颗粒细胞系KGN作为细胞模型,采用干扰RNA、过表达、添加抑制剂等实验,通过免疫化学发光检测细胞上清液雌激素合成,qRT-PCR以及Western Blot等实验方法来对人卵巢颗粒细胞内BMAL1对芳香化酶表达及雌激素合成调节的具体机制进行进一步的实验分析。结果:1.人卵巢颗粒细胞BMAL1与PCOS相关性研究:qRT-PCR结果显示,PCOS患者的卵巢颗粒细胞中BMAL1的mRNA表达水平显著低于非PCOS患者(p<0.05)。2.BMAL1在人卵巢颗粒细胞中对雌激素合成的具体调控机制的研究:结果显示,在KGN细胞中敲低BMAL1后细胞雌激素合成减少,同时其芳香化酶、SIRT1表达水平降低,过表达BMAL1后,细胞雌激素合成水平升高,芳香化酶及SIRT1表达水平升高。在KGN细胞中敲低SIRT1后细胞雌激素合成减少,同时芳香化酶、BMAL1表达水平降低,过表达SIRT1后,细胞雌激素合成水平升高,芳香化酶及BMAL1表达水平升高。BMAL1和SIRT1敲低后细胞JNK磷酸化水平降低,JNK过表达实验后细胞雌激素合成水平升高,芳香化酶,BMAL1及SIRT1表达水平均表现为升高。应用JNK或SIRT1抑制剂作用KGN细胞后,细胞雌激素合成降低,BMAL1、SIRT1和JNK表达水平下调;抑制剂作用于原代颗粒细胞后同样表现为细胞雌激素合成降低,BMAL1、SIRT1和JNK表达水平下调。结论:我们的研究阐述了BMAL1在人卵巢颗粒细胞中对雌激素合成的作用,发现了BMAL1-SIRT1这一正反馈环路在人卵巢颗粒细胞中的存在,并通过BMAL1-SIRT1这一正反馈环路调节芳香化酶的表达,最终影响雌激素的合成。同时,BMAL1在PCOS患者组与非PCOS患者组mRNA水平的差异提示我们BMAL1在PCOS发生发展过程中可能起到的一定的作用,这对于未来临床上对于PCOS的诊断、治疗及预后可能起到了一定的积极意义。