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随着基因工程技术的发展，细菌表面展示系统有很多应用于全细胞催化的报道，但是由于一些基因在原核表达系统中不能表达有活性的蛋白，使其应用受到极大的限制。与原核表达系统相比酵母表达系统具有无可比拟的优越性，其更适合于真核基因的表达，尤其是表达那些在翻译后需要加工修饰的蛋白质。另外，酵母细胞颗粒较大，能用流式细胞仪进行方便、快速的筛选，而且可以增加在全细胞催化反应中酶与底物的接触面以达到更高的催化效率。同时它还具有易于培养和可进行较方便的遗传操作的优势。酿酒酵母表面展示系统近几年来在细胞催化剂、环境治理、蛋白质文库筛选、高亲和抗体、生物传感器、抗原/抗体库构建、癌症诊断等领域均得到了迅猛发展，但作为可以进行高密度发酵的毕赤酵母的表面展示系统却鲜有报道。
本研究利用源于酿酒酵母絮凝膜蛋白Flolp的凝絮功能区作为展示锚合蛋白，构建新型的毕赤酵母表面展示载体。同时在分析抗菌肽结构和抗菌机制的基础上，设计并构建了抗菌肽Adenoregulin(ADR)的突变体ADRc，将此突变体融合6xHis标签和肠激酶识别位点作为目标蛋白验证该毕赤酵母展示系统的有效性。并对成功展示表达的抗菌肽ADRc的抑菌活性作了简要分析。具体内容包括：
1.抗菌肽突变体ADRc的确定和获得
通过对抗菌肽有关结构和作用机制的报道分析表明，其C-端的疏水性对抗菌肽活性至关重要。另外，关于ADR的cDNA研究表明天然的抗菌肽在体内先以前体的形式合成，后经过前体切割和翻译后修饰得到C-端酰胺化的活性形式。C-端酰胺化对抗菌活性虽然不是必需的，但是具有重要的意义。本实验设计将抗菌肽ADR靠近C-端31位上的谷氨酸Glu突变成谷氨酰胺Gln，从而增加C端的疏水性。目前，对于生物体内抗菌肽成熟过程中酰胺化机制尚不十分清楚，利用基因工程方法表达的抗菌肽难以酰胺化，这对重组抗菌肽的活性具有较大影响。我们将C-端Glu突变成Gln，以期模拟抗菌肽ADR的天然结构。据此构建得到相应的突变体ADRc。
2.毕赤酵母表面展示表达载体的构建及抗菌肽突变体ADRc的展示表达
根据所报道的酿酒酵母FLOl基因的核苷酸序列设计引物，经PCR扩增得到酿酒酵母细胞表面类似凝集素的絮凝素蛋白Flolp的凝絮功能区编码序列，将其编码的蛋白作为毕赤酵母展示表达载体的锚合蛋白。以毕赤酵母表达载体pPIC9K为基础，将絮凝素蛋白Flolp的凝絮功能区编码序列克隆到其中，分别构建得到带有α-因子信号肽编码序列和絮凝素蛋白Flolp自身信号肽编码序列的毕赤酵母展示表达载体pPIC9K-SFLO、pPIC9K-FLO。将融合6xHis标签以及肠激酶识别位点编码序列的ADRc基因分别利用这两个载体在毕赤酵母中实现展示表达。目标蛋白利用免疫荧光标记后通过荧光显微镜和激光共聚焦显微镜检测，证实其展示于毕赤酵母细胞表面。同时提取重组菌株膜组分后的点印迹实验也证实了该毕赤酵母展示系统的有效性。
3.抗菌肽突变体ADRc的活性分析
将展示有抗菌肽ADRc的重组毕赤酵母菌株用肠激酶消化处理，使重组ADRc从细胞表面释放，这可以作为一种蛋白纯化的新尝试。通过活性分析证明，游离的重组ADRc对于革兰氏阴性细菌及酿酒酵母都有一定的抑菌活性。毕赤酵母细胞表面展示的全细胞抗菌肽没有检测到抑菌活性。