论文部分内容阅读
将已经分化的体细胞人工去分化生成多能性干细胞的方法称为诱导多功能干细胞(iPSCs)方法。其诱导过程经历了“体细胞的重编程”。应用胚胎干细胞(ESCs)的裂解提取液也可以介导分化终端的体细胞发生“体细胞重编程”的过程，逆转化体细胞为多能干细胞，这种iPSCs方法称为细胞诱导法。这项技术是利用ESCs裂解液中丰富的多种转化因子直接诱导体细胞内与分裂增殖去分化相关基因的表达活性，在这个过程中既没有ESCs基因组染色质的直接参与，也没有使体细胞基因组的序列发生结构性变化，而只是重新激活了被诱导体细胞内与干细胞性状相关的基因，使其表达特性重新恢复到过去经历过的干细胞阶段，这是真正意义上的、比较“生理化”的、自然性逆分化过程。与其它iPSCs技术比较，细胞间的直接诱导技术，能够提高体细胞逆分化、重编程的效率，所生成多能干细胞的安全性强，具有重要的价值和广阔的应用前景。
但是，这种体细胞重编程逆转化体系中ESCs是直接参与者，被诱导的体细胞转化生产多能干细胞以后，这种被诱导产生的干细胞的现状和多种内在的性状都与诱导者相同或者相似，而且又是同时处于相同的生存环境中，在研究过程中要确定出现的多能干细胞的集落到底是来源于ESCs还是体细胞非常重要。因此，如何辨别多能干细胞来源是这个重编程体系的核心问题，直接关系到逆转化的成功与否。本研究主要是利用与诱导体细胞不同性别来源的ESCs裂解提取液，建立小鼠ESCs体外诱导已分化体细胞为多能干细胞的异性来源鉴别体系，以解决体细胞重编程结果来源不明的问题，并在此基础上进一步探讨ESCs裂解提取液介导的MEFs重编程逆转化为多能干细胞的可能性及转化效率。我们所建立的这种“异性来源鉴别体系”，方法简单，鉴别结果可靠。首先，通过不同性别生殖嵴形态学差异鉴别出小鼠13.5天胚胎的性别，并分离培养出雌性MEFs;然后，利用PCR鉴定滋养层细胞的性别来分离培养出雄性ESCs;然后，在上述研究基础上，使用雄性ESCs裂解提取液与雌性MEFs共孵育培养，诱导重编程体细胞为多能干细胞，通过检测所得多能干细胞的性别来确定其来源，建立小鼠ESCs体外诱导已分化体细胞为多能干细胞的异性来源鉴别体系，并且据此初步分析ESCs裂解提取液重编程体细胞的转化率。研究结果如下:
实验一:不同性别MEFs的分离培养
本研究利用妊娠13.5天雄性和雌性胎鼠的生殖嵴在形态学上存在明显差异的特性，识别出不同性别昆明系小鼠胚胎，并分离培养出大量不同性别的MEFs，用于多能干细胞的异性来源鉴别体系研究。根据雄性小鼠特异性的Y染色体性别决定区（SRY基因）的核心序列，设计一对引物，并对获得的不同性别MEFs的DNA样本进行PCR扩增，验证不同性别胎鼠生殖嵴在形态学上存在的差异。结果表明PCR性别鉴定结果与MEFs来源胚胎的性别一致。不同性别的MEFs均具有典型的成纤维细胞特性，两者在形态学上并没有差异。因此，利用雄性与雌性胚胎在生殖嵴形态学上的差异可以快速分离获得大量不同性别的MEFs，为多能干细胞的异性来源鉴别体系研究奠定基础。
实验二:小鼠ESCs的分离培养与性别鉴定
本研究采集妊娠4天昆明小鼠的囊胚进行无饲养层培养。3-5天后，选取明显隆起呈柱状的内细胞团进行分离培养ESCs，同时分别对与分离ESCs的内细胞团来源一致的滋养层细胞进行PCR性别鉴定。通过形态学观察、AKP染色、Oct-4和SSEA-1免疫细胞化学染色和EB三个胚层的标志基因RT-PCR检测进行ESCs的鉴定。结果表明采集妊娠4天昆明小鼠的囊胚进行体外培养，通过滋养层细胞的PCR性别鉴定，可以成功分离培养出不同性别的昆明小鼠ESCs，为多能干细胞的异性来源鉴别体系研究奠定基础。
实验三:应用小鼠ESCs裂解液重编程体细胞为iPSCs的异性来源鉴别体系研究
本研究利用液氮反复冻融7次的方法制备小鼠雄性ESCs提取液，用最终浓度为25U/100μ L的SLO渗透化作用经5-Aza-dC和TSA预处理雌性的MEFs，两者共孵育培养1小时后，使用含有2mM CaCl2的ESCs培养液进行封膜处理，然后在培养皿中制备成细胞悬液的培养液滴进行继续培养，对得到的细胞集落通过形态学观察、AKP染色、Oct-4免疫组化实验和分析多能性标志基因的表达，鉴定重编程多能干细胞的性状。最后，对得到的重编程多能干细胞，通过PCR性别鉴定的方法进行来源的可靠性鉴定。结果表明小鼠雄性ESCs提取液可以成功诱导雌性MEFs重编程逆转化为多能干细胞，经性别鉴定证实所得到的多能干细胞确实来源于雌性MEFs，从而证实了应用小鼠ESCs体外诱导已分化体细胞为多能干细胞的异性来源鉴别体系的可靠性。
结论:利用制备裂解液的多能干细胞（供体细胞）和被重编程的已分化体细胞（受体细胞）来源性别的不同，经PCR鉴定重编程多能干细胞的性别，可以快速准确地判定其来源，由此建立了小鼠ESCs体外诱导已分化体细胞为多能干细胞的异性来源鉴别体系，并可以有效应用于胚胎干细胞诱导产生iPSCs多能性干细胞的研究和生产应用过程中。