论文部分内容阅读
目的:探讨蓝光诱导人视网膜色素上皮（retinal pigment epithelial cells,RPE）细胞凋亡过程中,胞内钙离子(Ca2+)在Ca2+-PKC信号传导通路及与线粒体损伤的凋亡途径的相关作用机制。方法:原代培养健康人RPE细胞,传至第3-6代用于本实验。采用蓝光（470nm-490nm）,光照强度为（2,000±500）lx,经蓝光照射时间6h后,继续培养细胞24h,建立蓝光损伤人RPE细胞模型。采用免疫组化（IHC）染色光学显微镜下鉴定凋亡细胞,通过透射电镜（TEM）观察RPE的核型变和线粒体形态学改变。将体外培养的人RPE细胞随机分成4组:1A组:无光照组;1B组:光照组;1C组:光照+硝苯地平（Nifedipine）组;1D组:光照+（-）Bay K8644组。采用RT-PCR技术测定细胞膜L-型钙通道（L-type calcium channel）α1C、α1D、α1F亚型的m RNA表达量。将体外培养的人RPE细胞随机分成5组:2A组:无光照组;2B组:光照组;2C组:光照+硝苯地平组;2D组:光照+钙磷酸结合蛋白（Calphostin C）组;2E组:光照+佛波酯（PMA）组。激光扫描共聚焦显微镜（LSCM）用于检测各组RPE细胞内游离Ca2+浓度,分析荧光强度。采用非放射性核素法检测RPE胞内PKC活性。采用Western blot法测定各组RPE胞内Caspase-9蛋白的表达。将体外培养的人RPE细胞随机分为3组,3A组:（500±100）lx、（2,000±500）lx、（3,000±500）lx光照强度,光照时间6h,光照后细胞终止培养时间24h;3B组:（2,000±500）lx光照强度,光照时间3h、6h、12h、24h,,光照后细胞终止培养时间24h;3C组:（2,000±500）lx光照强度,光照时间6h,光照后细胞终止培养时间6h、12h、24h、36h和48h;对照组:无光照组,流式细胞术用于检测细胞线粒体跨膜电位（ΔψM）。将体外培养的人RPE细胞随机分为2组:4A组:光照强度（2,000±500）lx,光照时间6h,光照后细胞终止培养时间6、12、24、36h;4B组:光照强度（2,000±500）lx,光照时间12h,光照后细胞终止培养时间6h、12h、24h和36h,酶联免疫吸附试验（ELISA）测定细胞色素C（Cyt C）浓度。将体外培养的人RPE细胞分成2组:5A组:无光照组;5B组:单纯光照组,Western blot法测定Bax、Bcl-2、Bcl-xl蛋白表达量。采用SPSS 20.0统计学软件对实验数据进行统计学分析。结果:体外培养的人RPE细胞在蓝光（470-490nm）,光照强度（2000±500）lx,光照时间6h,光照后细胞终止培养时间24h后出现细胞凋亡,IHC染色表现为细胞核浓缩、染色质边聚成新月形、细胞核碎裂成数个;透射电子显微镜下观察可见线粒体膜破碎,嵴完全消失,染色质聚核膜边并浓集,呈现典型的细胞凋亡核型变。RT-PCR测定L-型膜型钙通道的α1C、α1D、α1F亚基m RNA表达量比较,差异均有统计学意义（F=45.92,P<0.05;F=50.32,P<0.05;F=18.50,P<0.05）。LSCM检测RPE细胞内游离Ca2+浓度结果显示,光照组（2E组>2B组>2D组>2C组,P<0.05）均高于无光照组（2A组）,差异具有统计学意义（F=26764.22,P<0.05）。非放射性核素法检测RPE细胞内PKC活性结果显示,光照组（2B组）IA值明显高于对照组（2A组）IA值（t=-9.869,P<0.05）。胞内Ca2+浓度与PKC活性通过线性回归分析显示:胞内Ca2+与PKC呈正相关关系（Y=53.032X+127.565,其中:r=0.990,t=13.931,P<0.05）。Western blot法测定各组RPE细胞内caspase-9蛋白相对表达量显示,2B、2D、2E组与2A组比较,caspase-9蛋白相对表达量均明显升高（P<0.05）。流式细胞术检测细胞线粒体膜电位（ΔψM）显示:3A组随着光照强度增加,RPE线粒体膜电位（ΔψM）开始下降（P<0.05）;3B组中光照6h、12h组与对照组比较,RPE线粒体膜电位（ΔψM）明显下降（P<0.05）;3C组中的光照6h、12h、24h、36h、48h与对照组比较,RPE线粒体膜电位（ΔψM）明显下降（P<0.05）。ELISA法测定Cyt C结果显示:4A组:光照6h处理继续培养的24h、36h组与对照组、6h、12h组比较,Cyt C浓度明显增加（P<0.05）。4B组:光照12h处理继续培养12h、24h、36h组与对照组比较,Cyt C浓度明显增加（P<0.05）。Western blot法测定Bax、Bcl-2、Bcl-xl蛋白表达量,结果显示:光照组（5B组）RPE细胞与无光照组（5A组）比较,Bax表达量增加,而Bcl-2、Bcl-xl表达量下降,差异均有统计学意义（P<0.05）,且Bax/Bcl-2值、Bax/Bcl-xl值与无光照组比较,明显高于无光照组,差异均有统计学意义（P<0.05）。结论:蓝光可诱导人RPE细胞凋亡,出现典型的细胞凋亡核型变和胞内线粒体损伤。蓝光照射后可引起RPE细胞膜L-型钙通道α1C、α1D、α1F亚基的m RNA表达增高,细胞内Ca2+荧光强度及PKC活性不同程度增强,且胞内Ca2+浓度及PKC活性呈正相关关系。与此同时,蓝光照射后RPE细胞线粒体膜电位（ΔψM）明显下降,Cyt C大量释放,促凋亡因子Bax与抑凋亡因子Bcl-2、Bcl-xl比值下调,触发caspase-9蛋白相对表达量增加,最终诱导细胞凋亡。钙离子同时参与Ca2+-PKC信号传导通路促凋亡过程及细胞线粒体凋亡途径,并起着启动、调控、促进细胞凋亡的关键作用。