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研究背景和目的:乳腺癌是女性发病率最高的恶性肿瘤之一,也是引起女性肿瘤相关性死亡的最主要原因之一。神经激肽P物质(Substance P,SP)通过结合其偏嗜性受体NK1R(Neurokinin-1 receptor,NK1R)激活下游信号调控,从而调控着人类乳腺癌发生发展的各个生理和病理过程。前期研究证实,NK1R有两种分子亚型:全长型亚型(full-length NK1R)NK1R-FL,和胞内羧基端缺少96个氨基酸的截短型亚型(truncated NK1R)NK1R-Tr。我们前期的研究结果也证实了NK1R-Tr的表达随着乳腺癌恶性程度的增高而增高,呈现正相关;而雌激素受体ERα的异常表达也会潜在诱发乳腺癌的发生;microRNA复杂的调控网络也参与了肿瘤发生、发展、侵袭和转移的各个过程。我们通过TargetScan等生物信息学软件预测,发现NK1R-Tr和ERα的mRNA 3’非编码区(3’Untranslated regions,3’-UTR)存在microRNA-22(mi R-22)的结合位点,那么mi R-22是否可以以碱基互补配对的方式结合到这个种子区,从而靶向下调二者的表达呢?本课题旨在阐明乳腺癌组织和细胞中,miR-22是否可以靶向下调NK1R-Tr和ERα的表达,从而抑制乳腺癌的增殖、侵袭和转移的能力,以及在这个过程中ERα与NK1R-Tr之间是否同样存在某种调控。研究方法:1.组织及细胞水平:RT-PCR研究乳腺癌旁正常组织及癌组织中mi R-22和NK1R-Tr的表达;RT-PCR和Western Blot法检测乳腺正常上皮细胞及各乳腺癌细胞的miR-22、NK1R-Tr和ERα的表达情况。2.荧光素酶报告基因实验与染色质免疫共沉淀实验(CHIP)研究mi R-22、NK1R-Tr和ERα三者之间的相互调控关系。3.小干扰RNA和ERα表达质粒构建MCF-7-ERαI及MDA-MB-231-ERα细胞系;小干扰RNA和NK1R-Tr表达质粒敲除或过表达MCF-7和MDA-MB-231细胞中的NK1R-Tr。4.乳腺癌细胞生物学行为的研究。用过表达miRNA-22的MCF-7和MDA-MB-231细胞进行CCK-8实验、克隆形成实验、划痕实验和侵袭转移实验,实验过程中均以野生型MCF-7和MDA-MB-231作为对照组。5.SP-NK1R-ERK1/2信号通路的研究。培养野生型MCF-7细胞作为对照组,实验组分别培养过表达miRNA-22的MCF-7细胞,野生型MCF-7细胞的培养基中加入NK1R拮抗剂。向实验组和对照组细胞中分别加入SP,进行刺激;到刺激时间后,终止。进行Western Blot实验。6.体内实验研究miRNA-22对乳腺癌细胞增殖与转移的影响。皮下成瘤组和转移瘤模型组小鼠分别由腹股沟处和尾静脉向小鼠体内接种过表达miRNA-22的MCF-7细胞或对照细胞。结果:1.miRNA-22、NK1R-Tr和ERα在乳腺癌组织及细胞系的表达谱:相较于癌旁组织,癌组织的miRNA-22表达明显降低,NK1R-Tr的表达则明显升高。而在乳腺癌细胞系MDA-MB-231、MCF-7、T47D、SK-BR-3中,miRNA-22的表达量明显低于在非肿瘤源性乳腺上皮细胞HBL-100的表达,NK1R-Tr的表达又明显高于HBL-100的表达。在MCF-7和T47D细胞中,NK1R-Tr和ERα双阳性表达。2.miRNA-22靶向下调NK1R-Tr和ERα的表达,ERα靶向上调NK1R-Tr的表达:荧光素酶报告基因实验结果示,转染了miRNA-22前体和ERα/NK1R-Tr表达质粒组的荧光素酶活性降低;在转染miRNA-22前体的细胞中,ERα和NK1R-Tr的表达量降低。CHIP实验结果示抗ERα抗体可以将NK1R-Tr的染色质片段富集沉淀下来,在转染了ERα和NK1R-Tr表达质粒的细胞荧光素酶活性明显增高。3.ERα增强miRNA-22对NK1R-Tr的下调作用:转染了miRNA-22前体的MCF-7-ERαI细胞中,NK1R-Tr的表达量下降幅度较小于野生MCF-7细胞;转染了miRNA-22前体的MDA-MB-231-ERα细胞,NK1R-Tr的表达量下降幅度大于野生MDA-MB-231细胞。4.miRNA-22抑制乳腺癌细胞的增殖、侵袭和转移能力:高表达miRNA-22的MCF-7细胞的增殖能力、克隆形成能力、迁移及侵袭能力均明显低于野生MCF-7细胞;在MDA-MB-231细胞中结果一致。5.miRNA-22延迟并减弱ERK1/2的磷酸化:相较于野生型MCF-7细胞,在高表达miRNA-22的MCF-7细胞中,ERK1/2的磷酸化水平升高的峰值延迟,并且峰值降低,与NK1R-Tr拮抗剂的效应一致;在MDA-MB-231细胞中结果一致。6.miRNA-22在体内抑制乳腺癌的增殖与转移:原位成瘤组,高表达miRNA-22的MCF-7细胞形成的肿瘤小于野生MCF-7细胞;转移瘤组,高表达miRNA-22的MCF-7细胞形成的肺转移灶少于野生MCF-7细胞,在MDA-MB-231细胞中结果一致。结论:在乳腺癌组织及细胞系中,mi RNA-22低表达、NK1R-Tr高表达,两者成负相关;mi RNA-22可以直接靶向下调NK1R-Tr的表达,从而通过调控ERK1/2信号通路,抑制乳腺癌的增殖与转移能力;这一过程也可通过ERα间接完成。