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选题依据:安全性是推动中医药事业高质量发展的根本保障,而配伍是临床合理、安全、有效用药的关键环节,在数千年的中医临床实践中,通过相畏相杀配伍可以有效降低中药的毒副作用,因此以中医药理论为基础开展中药配伍“减毒存效”机制研究意义重大。柴胡抗抑郁疗效确切,而在临床应用中发现,柴胡大剂量、长期使用存在“毒效并存”现象。20世纪90年代日本小柴胡汤毒性事件发生后,柴胡的毒副作用特别是其肝毒性也越来越引起国内外学者的关注。目前,2020版药典规定的柴胡用量仅为每人每日3～10 g,远低于仲景经方本源中的使用剂量22～125 g。时至今日,不少医生在治病开柴胡时,剂量过于谨慎,多用轻量,影响疗效。因此如何最大程度的发挥柴胡“疏肝解郁”的功效,同时限制其“劫肝阴”肝毒性的产生,成为制约柴胡临床合理用药的关键。总结柴胡配伍规律发现,复方中用柴胡,必与护阴药合用,如用于疏肝解郁时,常与白芍合用。柴胡、白芍配伍使用最早出现于汉代张仲景的《伤寒论》中,是“疏肝解郁、调畅情志”最基本的配伍药对,为多个“疏肝解郁”名方如《太平惠明和剂局方》中逍遥散、《景岳全书》中柴胡疏肝散、《伤寒论》中四逆散等的基础药物。在柴胡-白芍配伍药对中:柴胡辛散,疏肝解郁;白芍酸敛,养血柔肝。两药伍用,以白芍之酸敛,制柴胡之辛散,用柴胡之辛散,又佐白芍之酸敛,一散一收,疏肝之中兼敛肝,升阳之中兼敛阴,从而使柴胡“散而不伤肝阴”,为“散收”配伍的典型代表。此外,《内经》也曾指出:“肝郁气滞者,若气郁化火,火热本易伤阴”,进一步证实在疏肝解郁方中,柴胡常与养血柔肝的敛阴药—白芍合用的科学、合理性。因此,以解郁作用为依托,研究二者相杀配伍制约柴胡毒副作用及机制具有重要意义,有望成为解决柴胡“减毒存效”研究的突破口。然而,柴胡-白芍“散收”药对制约柴胡毒副作用的效应机制什么?其物质基础又是什么?以上问题尚不明确。目的:（1）明确柴胡的“量-效/毒”关系,全面分析柴胡-白芍配伍“减毒存效”作用。（2）系统阐明柴胡-白芍“散收”药对制约柴胡毒副作用的关键效应机制。（3）明确柴胡-白芍“散收”药对制约柴胡毒副作用的物质基础,揭示其关键分子靶标。方法:（1）柴胡“量-效/毒”关系分析及柴胡-白芍配伍减副作用评价以柴胡“疏肝解郁”功效及柴胡“劫肝阴”肝毒性为切入点,采用慢性不可预知应激（CUMS）抑郁大鼠模型,以糖水偏爱率、强迫游泳及旷场试验为抗抑郁药效为指标,进一步应用“肝阴亏虚”诊断指标及药物肝毒性指标综合评价柴胡的“量-效/毒”关系。其次,根据柴胡-白芍药对在复方中常用的配伍比例,评价柴胡与白芍1:1配伍时的抗抑郁作用;并通过“肝阴亏虚”诊断指标以及药物肝毒性指标评价柴胡-白芍配伍对柴胡毒副作用的影响,全面分析柴胡-白芍“散收”配伍药对“减毒存效”作用。（2）柴胡-白芍药对制约柴胡毒副作用的效应机制研究采用非靶向代谢组学技术对肝脏样本进行分析,初步明确柴胡-白芍药对通过调节哪些代谢途径发挥配伍减副作用;并运用代谢组学这种“自下而上”的酶靶发现策略,初步明确二者配伍制约柴胡毒副作用的潜在靶点。其次,以靶向代谢组学技术为研究手段,对非靶向代谢组学技术确定的关键代谢途径进行定性定量确证。最后,采用蛋白免疫印迹、酶联免疫吸附及生化酶活测定技术,对关键代谢通路中的相关靶点及其相关信号通路进行验证,明确柴胡-白芍药对制约柴胡毒副作用的关键效应机制。（3）柴胡-白芍药对制约柴胡毒副作用的物质基础研究整合UPLC-MS/MS分析、质谱背景扣除技术、多元统计分析方法研究柴胡-白芍配伍对柴胡入血、入肝成分整体差异的影响;在此基础上,对关键差异成分进行靶标定量确证。其次,通过外源化学成分组与内源代谢组的关联分析,初步明确影响配伍减副关键代谢途径及关键靶点的潜在化学成分。最后,综合运用分子对接、等温滴定量热分析及原子力显微镜技术对关键分子靶标进行结合模式及结合力测定,进一步通过体外酶活抑制率测定来验证配伍减副关键化学成分对关键靶点的调节作用,以期揭示柴胡-白芍药对制约柴胡毒副作用的潜在物质基础。（4）柴胡-白芍药对通过调节肠道菌群影响柴胡皂苷代谢转化的机制研究以上结果表明,配伍促进柴胡皂苷代谢转化为柴胡皂苷元是柴胡-白芍药对配伍减副的关键环节。结合相关文献报道,以肠道为分析对象,采用靶标定量分析方法对柴胡皂苷及柴胡皂苷元进行定性定量分析,初步明确柴胡-白芍药对是否通过调节肠道菌群影响柴胡皂苷的代谢转化。其次,利用肠道菌群16S r RNA三代全长测序技术,分析柴胡-白芍配伍前后对肠道菌群组成的影响;并利用PICRUSt2软件对获得的测序数据进行功能预测分析,结合功能单元PCo A分析筛选影响柴胡皂苷代谢转化的关键功能单元,并利用酶联免疫吸附技术对其关键功能单元进行验证分析。最后,通过构建“肠道菌群-差异成分”及“差异菌株-药物代谢酶”关联对,进一步筛选调控柴胡皂苷代谢转化的关键菌株,明确柴胡-白芍药对通过调节肠道菌群影响柴胡皂苷代谢转化的关键机制。结果:（1）柴胡“量-效/毒”关系分析及柴胡-白芍配伍减副作用评价研究结果柴胡在1.8 g/kg的给药剂量下（药典规定最高用量的1.7倍）,虽无毒副作用,但其抗抑郁作用并不显著。在3.6 g/kg-14.4 g/kg的给药剂量下抗抑郁作用明显,且药效呈剂量依懒性。提示柴胡在药典规定用量范围内,其抗抑郁作用并不明显;而在应用仲景经方本源中柴胡用量时,其抗抑郁作用效果显著。该研究结果印证了仝小林院士及李可老中医的观点:《药典》规定用量安全性有余而有效性明显不足。因此有必要参照仲景原方中柴胡用量进行有效性、安全性研究,以重新审视经方本源剂量来提高柴胡的临床疗效。但在柴胡“量-毒”关系研究发现,柴胡在7.2 g/kg、14.4 g/kg的剂量下连续给药7周后会出现“肝阴亏虚”及肝毒性的表现,而在配伍白芍后,其毒副作用明显缓解。证实在复方的配伍环境中,柴胡-白芍“散收”药对具有配伍减副作用,配伍是柴胡临床合理、安全、有效用药的关键环节。（2）柴胡-白芍药对制约柴胡毒副作用的效应机制研究结果整合非靶向代谢组学、靶向代谢组学、生物信息网络分析手段证实,谷胱甘肽代谢是柴胡-白芍配伍减副的关键代谢途径,谷胱甘肽代谢途径中谷胱甘肽合成酶（GSS）是柴胡-白芍配伍减副的潜在靶点。利用分子生物学技术发现,大剂量柴胡“劫肝阴”肝毒性的产生与抑制肝脏中GSS酶的活性有关,而并非影响GSS的蛋白表达水平。提示大剂量柴胡可能是通过影响GSS酶的四维空间结构,进而抑制其酶活性来影响GSS蛋白的功能。利用蛋白免疫印迹、酶联免疫吸附及生化酶活测定技术,确证了柴胡-白芍药对通过调控谷胱甘肽代谢、缓解大剂量柴胡对GSS酶活性的抑制作用,并进一步通过调节氧化应激和NF-κB/NLRP3通路发挥配伍减副的关键作用机制。（3）柴胡-白芍药对制约柴胡毒副作用的物质基础研究结果通过配伍前后对柴胡入血、入肝成分的整体差异分析、关键差异成分的靶标定量分析结果证实,在抑郁模型状态下,柴胡-白芍药对能促进柴胡皂苷在体内代谢转化为柴胡皂苷元,初步明确了柴胡-白芍药对配伍减副的潜在物质基础。进一步运用外源化学成分组与内源代谢组的关联分析、分子对接技术、等温滴定量热分析、原子力显微镜技术、以及体外酶活抑制率测定分析证实,柴胡皂苷A、柴胡皂苷D与GSS蛋白之间表现出较强的结合力,并呈剂量依赖性方式抑制GSS酶活性,导致谷胱甘肽途径代谢紊乱;而它们的脱糖基代谢转化产物—柴胡皂苷元F、柴胡皂苷元G则不能与GSS蛋白结合,且对GSS蛋白的催化功能无显著影响。明确了配伍促进柴胡皂苷在体内的代谢转化是柴胡-白芍药对制约柴胡毒副作用的关键物质基础。（4）柴胡-白芍药对通过调节肠道菌群影响柴胡皂苷代谢转化机制研究结果结合相关文献报道,采用靶标定量分析方法对肠道中柴胡皂苷及柴胡皂苷元进行定性定量分析,初步明确了肠道是配伍促进柴胡皂苷代谢转化的主要场所。利用肠道菌群16S r RNA三代全长测序技术、PICRUSt2功能预测分析方法、功能单元PCo A分析以及酶联免疫吸附技术,证实了柴胡-白芍配伍药对能促进肠道中具有糖苷酶活性的相关菌的丰度。进一步通过构建“肠道菌群-差异成分”关联对、“差异菌株-药物代谢酶”关联对,明确了柴胡-白芍药对可通过改变肠道菌群组成、增加肠道中Bacteroides、Escherichia＿coli和Lactobacillus＿koreensis等具有糖苷酶活性的相关菌的丰度,从而促进了柴胡皂苷的代谢转化。结论:综上,本研究结果证实,柴胡-白芍配伍药对可通过改变肠道菌群组成、增加肠道中Bacteroides、Escherichia＿coli和Lactobacillus＿koreensis等具有糖苷酶活性的相关菌的丰度,从而促进柴胡皂苷在体内的代谢转化,进而减轻对肝脏GSS酶的抑制作用,并进一步通过调节氧化应激和NF-κB/NLRP3信号通路逆转大剂量柴胡诱发的肝脏氧化应激损伤及炎症反应,发挥配伍减副作用。本课题的完成,为柴胡临床剂量及组方的合理使用提供科学依据,为疏肝解郁方中柴胡-白芍药对配伍的中医理论内涵提供现代科学解释,同时,对含柴胡的中药复方新药开发具有重要指导意义。