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人胚胎干细胞(Human embryonic stem cells,hESCs)是一种多潜能干细胞,具有在体外无限增殖、自我更新和向机体各种类型细胞分化的能力。hESCs在特定条件下可分化为胰岛素分泌细胞(Insulin-producing cells,IPCs),可以用于移植治疗Ⅰ型糖尿病,以解决临床治疗器官来源不足的问题。MiR-375是胰腺发育和成熟过程中必不可少的转录调控因子,在胰岛β细胞和非β细胞中均有表达,能够提高胰岛素转录水平,促进胰岛β细胞增殖。因此,研究miR-375在hESCs向IPCs分化过程中的作用,对于提高hESCs向IPCs分化的效率,获得单一表达Insulin的成熟胰岛β细胞具有重要意义。本研究在特定条件下使hESCs向IPCs分化,分化过程包括终末内胚层(Stage Ⅰ)、原肠(Stage Ⅱ)、内分泌前体(Stage Ⅲ)和胰腺内分泌细胞(Stage ⅣV)四个阶段。先以分化体系中的维甲酸(Retinoic acid,RA)为变量优化分化条件,再分别采用慢病毒介导的稳定过表达和脂质体介导的瞬时过表达提高细胞miR-375的表达水平,通过实时定量PCR检测miR-375和分化各阶段标志性基因Foxa2、Cxcr4、Ngn3、Pdx1、Insulin、Glucagon、Somatostatin的相对表达量,并通过免疫荧光染色和Elisa检测胰岛素合成和分泌情况,从而研究过表达miR-375对hESCs分化为IPCs的影响。1、为了优化hESCs分化为IPCs的培养条件,在终末内胚层向内分泌前体细胞分化的不同时间段添加2μMRA对细胞进行诱导,分别为不添加RA、在Stage Ⅱ 添加 RA、在 Stage Ⅲ 添加 RA、在 Stage Ⅱ 和 Stage Ⅲ 都添加 RA。研究发现在没有RA诱导的条件下,hESCs未能成功分化为IPCs;在Stage Ⅱ添加RA的条件下,胰向分化相关基因Foxa2、Cxcr4、Ngn2、Pdx1、Insulin、Glucagon和Somatoststin的相对表达量最高,并且在此条件下细胞一直保持良好的生长状态。因此在细胞分化Stage Ⅱ添加2 μMRA可作为分化培养的最佳条件。2、通过对hESCs进行慢病毒介导的miR-375稳定过表达,发现慢病毒感染会对hESCs的生长状态造成极大影响,降低细胞增殖分化能力并增加细胞凋亡,使细胞在分化早期大量死亡,进而导致hESCs无法分化产生IPCs。3、对分化不同时期的hESCs进行脂质体介导的miR-375 mimic转染,发现在分化早期过表达miR-375会提高Foxa2和Cxcr4的相对表达量,在分化中期过表达miR-375会提高Ngn3和Pdx1的相对表达量,在分化末期过表达miR-375会提高Insulin的相对表达量同时降低Glucagon和Somatostatin的相对表达量。并且瞬时过表达miR-375可促进胰岛素的合成和分泌。因此,在hESCs向IPCs分化过程中过表达miR-375可提高胰岛β细胞发育成熟相关基因的表达水平,降低分化末期细胞多激素共表达程度,促进β细胞成熟和胰岛素分泌。