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7-羟甲基叶绿素a还原酶(HCAR)催化叶绿素循环中叶绿素b转化为叶绿素a过程中的后半部分，7-羟甲基叶绿素a还原为叶绿素a的反应。HCAR通过调节叶绿素a/b之间的比例来稳定捕光复合物，在不断改变的外界环境中维持有效的光合作用。叶绿素循环途径也是叶绿素降解的必经途径，高效的酶活避免了叶绿素代谢中间产物对组织的损害。此外，7-羟甲基叶绿素a向叶绿素a的转变需要还原7-羟甲基上的碳氧键，由于碳氧键的高键能，此类反应在自然界中很少存在。 根据生物信息学结构同源性搜索，发现与其结构最相近的结构，F420镍铁氢化酶的β亚基FrhB，也仅有45％的覆盖率及21％相似度，因此HCAR的结构可能是一个新颖的结构。HCAR蛋白只存在于叶绿素循环进化完全的高等光合生物中，具有其专一性底物，在蓝藻等低等光合生物中也存在HCAR的同源蛋白DVR，催化3，8-二乙烯基原叶绿素酸酯的还原，二者序列同源性高达57％，但却催化不同的反应。研究认为HCAR可能由DVR进化而来。除此之外，HCAR不仅在叶绿素循环过程中发挥必不可少的作用，而且其催化反应的独特性与进化关系上的特殊性都决定了解析其三级结构的重要意义。 本文通过大肠杆菌体外表达系统获得高纯度重组蛋白，用X射线晶体学的方法解析了AtHCAR蛋白2.7(A。)的结构。通过对晶体结构分析发现，AtHCAR蛋白中结合有两个[4Fe-4S]簇和一个U形的FAD分子作为辅因子，通常在电子传递链中起着转移电子的作用。[4Fe-4S]簇与四个Cys形成配位键，FAD分子靠氢键结合，在AtHCAR分子中，各辅因子问间距分别为5.8(A。)和3.4(A。)，足够短的距离确保了电子从供体端向底物的转移。本文还结合体外初步的酶动力学实验进一步证明，AtHCAR分子以还原型铁氧还蛋白作为电子供体，通过分子内的电子转移链将电子转运到底物的催化位点。通过对突变体AtHCARS63A的酶活实验证明，在各辅因子间的电子传递为不依赖氨基酸的直接传递，AtHCARD237A的突变导致蛋白酶活的丧失，说明其在酶催化过程中发挥重要作用，结合结构分析Asp237位于FAD分子与底物之间，猜测其可能在电子传递过程中扮演着质子供体的作用。AtHCARH417N, AtHCARH417Y及AtHCARH417A突变体的蛋白纯化及酶活实验证明His417对于维持酶活也是必不可少的，其可能参与底物分子中心的Mg2+的结合。 根据所有的结构分析及体外生化实验，我们提出了AtHCAR催化7-羟甲基上的碳氧键的还原可能采用了质子偶联的电子转移策略。此外，结合进化分析与同源比对，发现AtHCAR的近端铁硫簇与FAD结合部分与F420-[NiFe]氢化酶的β亚基FrhB结构相似，并且AtHCAR多出了N端的远端铁硫簇结合部位与F420-[NiFe]氢化酶的γ亚基FrhG的[4Fe-4S]恰好重合。因此，我们认为AtHCAR与F420-[NiFe]氢化酶可能有着共同的祖先，在进化过程中，AtHCAR为了适应环境改变除进化出其特有的C端底物结合部位，并在F420-[NiFe]氢化酶的基础上做了部分的重建。另外，AtHCAR的三体结构为已报道的其可能与捕光复合物Ⅱ(LHCⅡ)相互作用提供了新的线索。