催吐萝芙木的植株再生体系的建立及遗传转化

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催吐萝芙木(RauvolfiavomitoriaAfzel.),夹竹桃科萝芙木属,是一种重要的药用植物,含有多种生物碱,如利血平具有降压功能,育亨宾用于治疗动脉硬化、风湿病等疾病。相比于萝芙木属其他植物,因其含有较高水平的利血平,催吐萝芙木在应用领域备受青睐。本文以催吐萝芙木为试材,通过单因素实验,研究不同植物生长调节剂、不同外植体、不同碳源对其愈伤组织诱导的影响,从而建立催吐萝芙木愈伤组织的培养体系,并在此基础上研究不同抗褐化剂对愈伤组织诱导的影响,植物生长调节剂对愈伤组织分化及植株生根的影响,建立了催吐萝芙木的植株再生体系,并初步进行了催吐萝芙木遗传转化的研究。  本论文获得了以下主要研究结果:  1.外植体消毒方法:顶芽以0.1%氯化汞进行消毒,时间设置为14~15min,加入1~2滴吐温可以增强消毒效果。叶片,茎段以2%次氯酸钠进行消毒,叶片消毒时间设置为7~8min,茎段消毒时间可稍微缩短,为5~6min,可取得较好的消毒效果。  2.外植体的选择:器官直接再生途径带节茎段要优于茎尖,带节茎段启动快,启动率高,污染率底。愈伤组织宜选择茎段,叶片愈伤组织难于分化。  3.愈伤组织的诱导及分化:单种植物生长调节剂对愈伤组织的诱导效果均不佳,两植物生长调节剂搭配的实验中,MS+2,4-D2.0mg/L+TDZ0.5mg/L的激素组合,对叶片及茎段进行愈伤组织的诱导效果最好,但叶片诱导的愈伤组织置于各种培养基中,几个月都未见分化。MS+6-BA3.0mg/L+NAA0.1mg/L培养基是适合愈伤组织分化的培养基。  4.不同的碳源对愈伤组织诱导及生长的影响:对于愈伤组织的诱导来说,合适的碳源为蔗糖和果糖,适宜的碳源浓度为30g/L。  5.不同的防褐化剂对愈伤组织诱导的影响:0.01~0.05mg/L的半胱氨酸、0.1~0.2mg/LAgNO3、0.1~0.2mg/L柠檬酸、0.1~0.2mg/L维生素C都可以有效的防止愈伤组织的褐化,而且不影响愈伤组织的产生。1~4g/L的活性炭抗褐化效果最佳,但是抑制愈伤组织的生长。  6.不同激素对芽增值的影响:在MS+6-BA3.0mg/L,+NAA0.1mg/L培养基中,芽的增值倍数最高,可达到27倍。MS+6-BA1.0mg/L+NAA0.1mg/L是适宜芽壮苗的培养基。赤霉素可影响芽的生长,芽随着赤霉素浓度的升高而升长,但是芽的质量均不佳,比较纤细。  7.生根诱导及炼苗移栽:由NAA、IBA两种植物生长调节剂处理发现0.1~0.5mg/L的NAA最适合催吐萝芙木试管苗生根。在添加0.1mg/LNAA的培养基中,试管苗长出的根细而长,而在添加0.5mg/LNAA的培养基中,试管苗长出的根多而粗。因此在后者培养基中更容易移栽成活。IBA、NAA两种植物生长调节剂的混合对根的生长并没有相互促进作用,生根率反而降低。  8.毛状根的诱导:用野生型及转基因型的C58C1感染实生苗的叶片及茎段,无菌苗的叶及茎段,实生苗的叶及茎段都没有长出不定根,而无菌苗的叶及茎段都能长出不定根,发现茎段比叶更容易诱导出不定根,诱导时间相对较短,生长相对较快。
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