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抗生素耐药性细菌是威胁人类和动物健康的普遍问题。大肠杆菌作为重要的食源性机会致病菌,其抗生素耐药性带来的治疗失败逐年增加,世界卫生组织2017年发布的抗生素研发重点病原菌名单中,前三名是鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌和肠杆菌科细菌。由于细菌抗生素耐药性发生发展速度远超新型抗生素的研发速度,因此迫切需要开发替代疗法。噬菌体由于其宿主特异性,对治疗的患者细胞和正常菌群无作用且能够不断进化以对抗细菌产生的抗性,因此获得了新的关注。尽管已经开展了大量的噬菌体单一或联合疗法的研究,目前仍不明确噬菌体对细菌的裂解效果是否会受到迅速增加的抗生素耐药性的影响。本研究以实验室保存的肌尾噬菌体科噬菌体vB_EcoM-ep3和大肠杆菌CVCC1418为主要研究对象,寻找氨苄西林耐药性影响噬菌体裂解大肠杆菌的分子机制。首先,我们发现多重耐药性大肠杆菌菌株O78-6对噬菌体vB_EcoM-ep3的敏感性显著高于同属于O78血清组的菌株CVCC1418。通过抗生素驯化获得自发突变氨苄西林耐药菌株CVCC1418AmpR和环丙沙星耐药突变株CVCC1418CipR,检测噬菌体vB_EcoM-ep3的裂解效果,结果显示与亲本菌株CVCC1418相比,氨苄西林耐药突变株CVCC1418AmpR的噬菌体敏感性增加,而环丙沙星耐药突变株CVCC1418CipR的噬菌体敏感性没有显著变化。检测氨苄西林对实验室保存的大量大肠杆菌临床分离株的最小抑菌浓度,根据MIC选取其中的34株大肠杆菌,将其分为氨苄西林低耐药组(MIC≤25 mg/L,共15株)和氨苄西林高耐药组(MIC≥800 mg/L,共19株),用这些菌株作为宿主菌共分离到81株噬菌体,检测这些噬菌体对34株大肠杆菌的裂解范围,并分析噬菌体裂解效率与氨苄西林对其宿主菌最小抑菌浓度的关系,结果表明氨苄西林耐药性的增加与大肠杆菌噬菌体敏感性的升高具有密切关联,且这一现象在O78血清组菌株中较为明显,提示这些分离株可能具有相同的参与噬菌体的结合的LPS。但是,并非所有O78来源的噬菌体都能够感染所有O78血清组菌株,这表明可能涉及其他噬菌体受体,这些噬菌体受体在这些分离株中的表达和/或可及性有所不同。为了探索氨苄西林耐药性促进噬菌体裂解大肠杆菌这一现象的机制,本研究利用iTRAQ技术分析亲本菌株CVCC1418和氨苄西林耐药突变菌株CVCC1418AmpR蛋白组学差异。iTRAQ蛋白组学实验共鉴定到54个CVCC1418AmpR的差异表达蛋白,其中31个蛋白表达上调,23个蛋白表达下调。与CVCC1418相比,CVCC1418AmpR中大量代谢通路相关蛋白发生变化;细菌的趋化、信号转导、鞭毛合成相关的多个蛋白表达改变,以便细菌及时响应外界刺激;多个外膜孔蛋白表达差异显著,以加速抗生素外排并减少抗生素摄取;β-内酰胺酶显著上调,以促进氨苄西林的水解,从根本上抵抗氨苄西林的杀菌作用。由蛋白组学结果可以看出,细菌启动多种机制以抵御抗生素的杀伤。同时我们使用转座子随机插入系统构建菌株CVCC1418AmpR转座子随机插入突变库,筛选到67个噬菌体vB_EcoM-ep3裂解效率下降的突变株,并鉴定这些菌株的转座子插入位点为ampC或ampR。由于iTRAQ蛋白组学结果中AmpC在菌株CVCC1418AmpR表达显著上调,因此选择AmpC作为后续研究的主要对象,荧光定量PCR证实14和53号突变株转座子插入位点确为ampC,且与CVCC1418AmpR相比,两个突变株对氨苄西林的敏感性均显著增加。为了进一步确定AmpC对噬菌体裂解大肠杆菌的影响,我们构建了AmpC过表达菌株CVCC1418pAmpC,与亲本菌株CVCC1418对比,CVCC1418pAmpC的噬菌体裂解效率和吸附效率显著增加。接着我们尝试构建了ampC敲除菌株,在CVCC1418AmpR中多次尝试未果,但在K12 MG1655中的成功敲除ampC获得菌株K12ΔAmpC,并构建了回补菌株K12ΔAmpCpAmpC,对比噬菌体的裂解效果,结果表明敲除ampC基因显著抑制噬菌体的裂解效率和吸附效率,回补ampC后噬菌体的裂解效率有所回升。由于大肠杆菌中直接影响噬菌体吸附的主要是外膜蛋白,因此我们检测了产量受AmpC表达变化影响的外膜蛋白,外膜蛋白OmpA转录水平随AmpC表达增强而增加。而已有OmpA作为噬菌体受体相关报道,因此我们推测AmpC可能通过调节OmpA的表达影响噬菌体裂解作用。为了确定OmpA是否为噬菌体vB_EcoM-ep3在宿主菌表面的受体,我们进行了pull-down试验,并利用质谱鉴定可能与噬菌体vB_EcoM-ep3受体结合蛋白Dpo41相互作用的大肠杆菌表面的受体,共鉴定到三个假定噬菌体受体:脂蛋白LPP、外膜蛋白OmpA和烯醇化酶Eno。为了进一步确定噬菌体受体,我们原核表达并纯化鉴定到的蛋白,并利用免疫共沉淀检测其与Dpo41是否结合,结果显示OmpA确为Dpo41在菌体表面的受体。因此AmpC在菌株CVCC1418中的上调促进噬菌体受体OmpA的表达,细菌表面增加的噬菌体受体为噬菌体提供了更多结合宿主的机会,从而导致噬菌体裂解效率的提高。我们的研究证明即使针对于抗生素耐药性迅速增加的大肠杆菌,噬菌体仍然可以有效的发挥杀菌作用,从一定程度解释了噬菌体-抗生素联合应用能够显著抑制抗生素耐药性产生这一现象的机制。为噬菌体-抗生素在感染性疾病中联合应用的协同作用提供了理论和实验依据。