【摘 要】
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采用PCR技术扩增了松材线虫纤维素酶的编码基因,克隆基因与已报道的纤维素酶BXC10基因的同源性高达99%。将其克隆到组成型表达载体pET-15b上构建pET-15b-BXC,并将该重组质粒
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采用PCR技术扩增了松材线虫纤维素酶的编码基因,克隆基因与已报道的纤维素酶BXC10基因的同源性高达99%。将其克隆到组成型表达载体pET-15b上构建pET-15b-BXC,并将该重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株构建工程菌,SDS-PAGE分析表明,IPTG诱导了纤维素酶在工程菌中表达。采用Ni2+-NTA树脂和阴离子(DEAE)交换树脂对重组蛋白分离纯化,SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其纯化程度,DNS法测定其纤维素酶的活性及其最适温度、最适pH和其热稳定性、pH稳定性。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明,亲和层析后重组蛋白质的纯度为50%左右,经阴离子(DEAE)交换树脂分离纯化后,只得到均一的一条带,大小为40 kDa。活性分析表明工程菌表达的重组蛋白具有纤维素酶活性,其最适温度为45℃,最适pH为40。实验结果还证明该蛋白具有很好的热稳定性：不同温度处理1h后,该蛋白在45℃-65℃范围内可保持70%以上的纤维素酶酶活力,70℃以后,其纤维素酶酶活力下降迅速,80℃时其纤维素酶酶活力几乎完全丧失,45℃时剩余纤维素酶酶活最高,可达98%；该蛋白pH稳定性也很好：其纤维素酶酶活在pH3.0-5.0范围内其酶活稳定性逐步上升,并在pH5.0时酶活稳定性达到最高。本实验结果可为进一步研究松材线虫纤维素酶在松萎蔫病中的作用奠定基础。
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