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本文主要研究丁酸梭菌（Clostridium butyricum，CB）缓解产肠毒素大肠杆菌K88（Enterotoxigenic Escherichia coli K88，ETEC K88）和猪霍乱沙门氏菌（Salmonella choleraesuis，SC）造成的猪肠上皮细胞损伤的分子机制。试验由三部分组成：
试验一：（1）试验从健康断奶仔猪的粪便中利用常规方法分离得到相似菌落并进行纯培养，经生化检测、16S rDNA基因测序和同源性分析，确定其菌株；（2）采用活菌计数法和牛津杯法研究分离菌种培养上清对两种致病菌的抑制作用；（3）利用体外细胞试验研究分离菌株黏附猪肠上皮细胞（IPEC-J2）的特性、对IPEC-J2的生长影响及其对致病菌黏附细胞的抑制作用。结果表明：
（1）本试验成功分离得到一株丁酸梭菌；（2）与对照组相比，CB培养上清液对两种致病菌的抑菌效果（P<0.05）和抑菌圈直径（P<0.05）差异均显著；（3）CB可黏附于IPEC-J2，与对照组相比，MOI为1、10、50时试验组细胞数均无显著差异（P>0.05），MOI为100时试验组细胞数显著下降（P<0.05）。与对照组相比，CB对ETEC K88和SC黏附IPEC-J2均具有显著抑制作用（P<0.05），并且对SC黏附的抑制效果为较好。
试验二：（1）选用一定浓度（5×107CFU/mL）的CB与IPEC-J2分别作用0h、3h、6h、12h、24h，比较不同作用时长对CB黏附IPEC-J2能力的影响。选用不同感染复数的CB（MOI=1、10、50、100）孵育细胞3h后，利用ELISA方法检测细胞培养上清中IL-8、IL-1β和TNF-α的浓度，以及CB黏附细胞的数量和细胞的形态变化、存活数目，确定CB发挥益生作用的最佳使用剂量；（2）选用不同浓度的SC作用细胞6h后，利用ELISA方法检测细胞培养上清中IL-8、IL-1β和TNF-α的浓度，以及乳酸脱氢酶（LDH）的含量，确定SC引起IPEC-J2损伤的最佳剂量；（3）选用以上确定好的SC最佳剂量分别处理IPEC-J23h、6h、12h、24h后，利用ELISA方法检测细胞培养上清中IL-8、IL-1β和TNF-α的浓度，统计数据，分析比较SC感染IPEC-J2后细胞因子的动态表达情况；（4）选用以上确定好的SC的最佳剂量分别处理IPEC-J23h、6h、12h、24h后，利用qPCR方法检测细胞中紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达情况，确定SC作用细胞不同时长后细胞间紧密连接蛋白的变化规律。结果表明：
（1）与对照组相比，当MOI为1时，IL-1β、IL-8和TNF-α的浓度均没有显著变化（P>0.05），当MOI为10时，IL-8和TNF-α的浓度均显著增加（P<0.05），而IL-1β的浓度没有显著变化（P>0.05），MOI为50和100时，IL-1β、IL-8和TNF-α的浓度均显著增加（P<0.05）。与MOI=1、10和100相比，MOI=50时丁酸梭菌的黏附能力最强（P<0.01），显微观察发现MOI=100时，较多的细胞形态发生了改变，并伴有部分细胞漂浮于培养液中。且采用台盼蓝进行活细胞染色，与对照组相比，MOI=1、10、50时，细胞数量无显著变化，MOI=100时，细胞数量显著降低（P<0.05）。因此，最终确定CB发挥益生作用的最佳MOI为50；（2）与对照组相比，SC浓度为1×102CFU/mL时，促炎性细胞因子IL-8变化不显著，IL-1β、TNF-α和细胞毒性均显著升高（P<0.05）。当SC为1×103CFU/mL、1×104CFU/mL时，促炎性细胞因子IL-8、IL-1β、TNF-α和细胞毒性均显著升高（P<0.05）。但SC为1×104CFU/mL时，细胞损伤较严重，出现部分死亡飘起，因此最终确定SC使用的最佳剂量为1×103CFU/mL；（3）与对照组相比，SC作用细胞3h、6h、12h、24h后，促炎性细胞因子IL-8、IL-1β、TNF-α显著上调（P<0.05），由此确定此剂量的SC使细胞产生了免疫反应；（4）与对照组相比，SC作用细胞3h、6h、12h、24h后，紧密连接蛋白mRNA的表达量均显著降低（P<0.05），由此表明此剂量的SC破坏了细胞之间的紧密连接蛋白，引起了细胞损伤。
试验三：（1）将IPEC-J2接种于六孔板中，待细胞融合度达到80%，用CB（MOI=50）孵育细胞3h，再分别用ETEC K88（浓度为1×103CFU/mL）和SC（浓度为1×103CFU/mL）刺激细胞3h、6h、12h、24h后收集细胞。分组情况为未作处理的空白组（对照组）、ETEC K88感染细胞组（ETEC组）、SC感染细胞组（SC组）、CB预处理后ETEC K88感染细胞组（CB+ETEC组）、CB预处理后SC感染细胞组（CB+SC组）。采用qPCR检测紧密连接蛋白ZO-1和Occludin以及β-catenin、cyclin D1和c-Myc的表达水平，采用ELISA方法检测细胞培养上清液中TNF-α和IL-8的含量，分析丁酸梭菌对致病菌感染的IPEC-J2中NF-κB信号通路和β-catenin信号通路活化的影响；（2）用NF-κB抑制剂（BAY11-7082）处理IPEC-J21h抑制IPEC-J2中NF-κB的活化，同时设立未抑制细胞对照组；用CB处理各组细胞3h，再用两种致病菌分别处理各组细胞，处理6h、12h、18h后收集细胞。采用qPCR检测NF-κB、紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达水平，采用ELISA方法检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-8和LDH的含量，确定CB是否通过NF-κB信号通路减轻致病菌造成的猪肠上皮细胞损伤；（3）用siRNA沉默IPEC-J2中β-catenin的表达，同时设立未沉默的细胞对照组；用CB处理各组细胞3h，再用两种致病菌分别处理各组细胞，处理6h、12h、18h后收集细胞及其培养上清液。采用qPCR方法检测细胞中β-catenin、cyclin D1和c-Myc的表达，采用ELISA方法检测细胞培养上清液中LDH的含量，确定CB是否通过β-catenin信号通路促进致病菌造成的猪肠上皮细胞损伤的修复。结果表明：
（1）①与对照组相比，ETEC组3h时TNF-α和IL-8均显著升高（P<0.05），SC组3h时IL-8显著升高（P<0.05），ETEC组和SC组在6h、12h、24h时TNF-α和IL-8均极显著升高（P<0.01）。CB+ETEC组与ETEC组相比，在6h、12h、24h时TNF-α和IL-8表达量均显著降低（P<0.05，P<0.01，P<0.01）。②与对照组相比，ETEC组在各时间段紧密连接蛋白ZO-1表达量均显著降低（P<0.05），3h时紧密连接蛋白Occludin表达量差异不显著（P>0.05），在6h、12h和24h后紧密连接蛋白Occludin表达量均极显著降低（P<0.01）。CB+ETEC组与ETEC组相比，紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达量均极显著升高（P<0.01）。SC和ETEC K88有相似的结果。表明CB上调了ETEC K88和SC感染的紧密连接蛋白的相对表达量；③与对照组相比，ETEC组和SC组在各时间段NF-κB表达量均极显著上升（P<0.01）。CB+ETEC组与ETEC组相比，NF-κB表达量在各时间段均显著下降（P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.01）。CB+SC组与SC组相比，NF-κB表达量在各时间段均极显著下降（P<0.01）；④与对照组相比，ETEC组在6h和24h后β-catenin表达量均极显著降低（P<0.01），在6h、12h和24h后cyclin D1和c-Myc表达量均显著降低（P<0.05），CB+ETEC组与ETEC组相比，β-catenin、cyclin D1、c-Myc表达量在各时间段均显著升高（P<0.05）。与对照组相比，SC组在24h后β-catenin、cyclin D1、c-Myc表达量极显著降低（P<0.01），CB+SC组与SC组相比，β-catenin、cyclin D1、c-Myc表达量在各时间段均显著升高（P<0.05）。表明CB通过活化β-catenin信号通路缓解致病菌引起的猪肠上皮细胞损伤；（2）与对照组相比，DMSO组各时间段NF-κB、ZO-1、Occludin、TNF-α、IL-8和LDH含量变化差异均不显著（P>0.05），抑制剂组各时间段NF-κB含量均极显著降低（P<0.01），紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、TNF-α、IL-8和LDH含量变化差异均不显著（P>0.05），DMSO+ETEC组、DMSO+SC组各时间段NF-κB、TNF-α、IL-8和LDH含量均极显著升高（P<0.01），紧密连接蛋白ZO-1和Occludin含量均极显著降低（P<0.01）。与DMSO+ETEC组相比，抑制剂+ETEC组和DMSO+CB+ETEC组、抑制剂+CB+ETEC组各时间段NF-κB、TNF-α、IL-8和LDH含量均极显著降低（P<0.01），紧密连接蛋白ZO-1和Occludin含量均极显著升高（P<0.01）。与DMSO+SC组相比，抑制剂+SC组和抑制剂+CB+SC组相关蛋白表达量变化情况与ETEC处理相似。表明，NF-κB信号通路抑制剂和CB都可以降低致病菌诱导的IPEC-J2损伤；（3）与对照组相比，NC组各时间段β-catenin、cyclin D1、c-Myc和LDH含量均无明显变化（P>0.05），si RNA组、si RNA+ETEC组、si RNA+SC组，β-catenin、cyclin D1和c-Myc含量均极显著降低（P<0.01），LDH含量均极显著升高（P<0.01）。与NC+ETEC组相比，si RNA+ETEC组β-catenin、cyclin D1和c-Myc含量均极显著降低（P<0.01），LDH含量均显著增加（P<0.01，P<0.01，P<0.05），si RNA+CB+ETEC组β-catenin、cyclin D1和c-Myc含量均极显著降低（P<0.01），LDH含量18h时极显著降低（P<0.01），NC+CB+ETEC组β-catenin、cyclin D1和c-Myc含量均极显著升高（P<0.01），LDH含量均极显著降低（P<0.01）。与NC+SC组相比，si RNA+SC组、si RNA+CB+SC组和NC+CB+ETEC组相关蛋白表达量变化情况与ETEC处理相似。表明，β-catenin信号通路下调可以加重致病菌造成的IPEC-J2损伤，CB可通过上调β-catenin信号通路缓解这种损伤。
综上所述，从仔猪粪便分离得到的CB可以抑制ETEC K88和SC的生长，并可通过黏附到猪小肠上皮细胞抑制致病菌的黏附，降低其致病性，而且还可以调控NF-κB和β-catenin信号通路关键蛋白的表达，缓解由ETEC K88和SC感染引起的细胞损伤，为丁酸梭菌在仔猪日粮中的应用提供理论依据。
试验一：（1）试验从健康断奶仔猪的粪便中利用常规方法分离得到相似菌落并进行纯培养，经生化检测、16S rDNA基因测序和同源性分析，确定其菌株；（2）采用活菌计数法和牛津杯法研究分离菌种培养上清对两种致病菌的抑制作用；（3）利用体外细胞试验研究分离菌株黏附猪肠上皮细胞（IPEC-J2）的特性、对IPEC-J2的生长影响及其对致病菌黏附细胞的抑制作用。结果表明：
（1）本试验成功分离得到一株丁酸梭菌；（2）与对照组相比，CB培养上清液对两种致病菌的抑菌效果（P<0.05）和抑菌圈直径（P<0.05）差异均显著；（3）CB可黏附于IPEC-J2，与对照组相比，MOI为1、10、50时试验组细胞数均无显著差异（P>0.05），MOI为100时试验组细胞数显著下降（P<0.05）。与对照组相比，CB对ETEC K88和SC黏附IPEC-J2均具有显著抑制作用（P<0.05），并且对SC黏附的抑制效果为较好。
试验二：（1）选用一定浓度（5×107CFU/mL）的CB与IPEC-J2分别作用0h、3h、6h、12h、24h，比较不同作用时长对CB黏附IPEC-J2能力的影响。选用不同感染复数的CB（MOI=1、10、50、100）孵育细胞3h后，利用ELISA方法检测细胞培养上清中IL-8、IL-1β和TNF-α的浓度，以及CB黏附细胞的数量和细胞的形态变化、存活数目，确定CB发挥益生作用的最佳使用剂量；（2）选用不同浓度的SC作用细胞6h后，利用ELISA方法检测细胞培养上清中IL-8、IL-1β和TNF-α的浓度，以及乳酸脱氢酶（LDH）的含量，确定SC引起IPEC-J2损伤的最佳剂量；（3）选用以上确定好的SC最佳剂量分别处理IPEC-J23h、6h、12h、24h后，利用ELISA方法检测细胞培养上清中IL-8、IL-1β和TNF-α的浓度，统计数据，分析比较SC感染IPEC-J2后细胞因子的动态表达情况；（4）选用以上确定好的SC的最佳剂量分别处理IPEC-J23h、6h、12h、24h后，利用qPCR方法检测细胞中紧密连接蛋白Occludin和ZO-1的表达情况，确定SC作用细胞不同时长后细胞间紧密连接蛋白的变化规律。结果表明：
（1）与对照组相比，当MOI为1时，IL-1β、IL-8和TNF-α的浓度均没有显著变化（P>0.05），当MOI为10时，IL-8和TNF-α的浓度均显著增加（P<0.05），而IL-1β的浓度没有显著变化（P>0.05），MOI为50和100时，IL-1β、IL-8和TNF-α的浓度均显著增加（P<0.05）。与MOI=1、10和100相比，MOI=50时丁酸梭菌的黏附能力最强（P<0.01），显微观察发现MOI=100时，较多的细胞形态发生了改变，并伴有部分细胞漂浮于培养液中。且采用台盼蓝进行活细胞染色，与对照组相比，MOI=1、10、50时，细胞数量无显著变化，MOI=100时，细胞数量显著降低（P<0.05）。因此，最终确定CB发挥益生作用的最佳MOI为50；（2）与对照组相比，SC浓度为1×102CFU/mL时，促炎性细胞因子IL-8变化不显著，IL-1β、TNF-α和细胞毒性均显著升高（P<0.05）。当SC为1×103CFU/mL、1×104CFU/mL时，促炎性细胞因子IL-8、IL-1β、TNF-α和细胞毒性均显著升高（P<0.05）。但SC为1×104CFU/mL时，细胞损伤较严重，出现部分死亡飘起，因此最终确定SC使用的最佳剂量为1×103CFU/mL；（3）与对照组相比，SC作用细胞3h、6h、12h、24h后，促炎性细胞因子IL-8、IL-1β、TNF-α显著上调（P<0.05），由此确定此剂量的SC使细胞产生了免疫反应；（4）与对照组相比，SC作用细胞3h、6h、12h、24h后，紧密连接蛋白mRNA的表达量均显著降低（P<0.05），由此表明此剂量的SC破坏了细胞之间的紧密连接蛋白，引起了细胞损伤。
试验三：（1）将IPEC-J2接种于六孔板中，待细胞融合度达到80%，用CB（MOI=50）孵育细胞3h，再分别用ETEC K88（浓度为1×103CFU/mL）和SC（浓度为1×103CFU/mL）刺激细胞3h、6h、12h、24h后收集细胞。分组情况为未作处理的空白组（对照组）、ETEC K88感染细胞组（ETEC组）、SC感染细胞组（SC组）、CB预处理后ETEC K88感染细胞组（CB+ETEC组）、CB预处理后SC感染细胞组（CB+SC组）。采用qPCR检测紧密连接蛋白ZO-1和Occludin以及β-catenin、cyclin D1和c-Myc的表达水平，采用ELISA方法检测细胞培养上清液中TNF-α和IL-8的含量，分析丁酸梭菌对致病菌感染的IPEC-J2中NF-κB信号通路和β-catenin信号通路活化的影响；（2）用NF-κB抑制剂（BAY11-7082）处理IPEC-J21h抑制IPEC-J2中NF-κB的活化，同时设立未抑制细胞对照组；用CB处理各组细胞3h，再用两种致病菌分别处理各组细胞，处理6h、12h、18h后收集细胞。采用qPCR检测NF-κB、紧密连接蛋白ZO-1和Occludin的表达水平，采用ELISA方法检测细胞培养上清液中TNF-α、IL-8和LDH的含量，确定CB是否通过NF-κB信号通路减轻致病菌造成的猪肠上皮细胞损伤；（3）用siRNA沉默IPEC-J2中β-catenin的表达，同时设立未沉默的细胞对照组；用CB处理各组细胞3h，再用两种致病菌分别处理各组细胞，处理6h、12h、18h后收集细胞及其培养上清液。采用qPCR方法检测细胞中β-catenin、cyclin D1和c-Myc的表达，采用ELISA方法检测细胞培养上清液中LDH的含量，确定CB是否通过β-catenin信号通路促进致病菌造成的猪肠上皮细胞损伤的修复。结果表明：
（1）①与对照组相比，ETEC组3h时TNF-α和IL-8均显著升高（P<0.05），SC组3h时IL-8显著升高（P<0.05），ETEC组和SC组在6h、12h、24h时TNF-α和IL-8均极显著升高（P<0.01）。CB+ETEC组与ETEC组相比，在6h、12h、24h时TNF-α和IL-8表达量均显著降低（P<0.05，P<0.01，P<0.01）。②与对照组相比，ETEC组在各时间段紧密连接蛋白ZO-1表达量均显著降低（P<0.05），3h时紧密连接蛋白Occludin表达量差异不显著（P>0.05），在6h、12h和24h后紧密连接蛋白Occludin表达量均极显著降低（P<0.01）。CB+ETEC组与ETEC组相比，紧密连接蛋白ZO-1、Occludin表达量均极显著升高（P<0.01）。SC和ETEC K88有相似的结果。表明CB上调了ETEC K88和SC感染的紧密连接蛋白的相对表达量；③与对照组相比，ETEC组和SC组在各时间段NF-κB表达量均极显著上升（P<0.01）。CB+ETEC组与ETEC组相比，NF-κB表达量在各时间段均显著下降（P<0.05，P<0.05，P<0.01，P<0.01）。CB+SC组与SC组相比，NF-κB表达量在各时间段均极显著下降（P<0.01）；④与对照组相比，ETEC组在6h和24h后β-catenin表达量均极显著降低（P<0.01），在6h、12h和24h后cyclin D1和c-Myc表达量均显著降低（P<0.05），CB+ETEC组与ETEC组相比，β-catenin、cyclin D1、c-Myc表达量在各时间段均显著升高（P<0.05）。与对照组相比，SC组在24h后β-catenin、cyclin D1、c-Myc表达量极显著降低（P<0.01），CB+SC组与SC组相比，β-catenin、cyclin D1、c-Myc表达量在各时间段均显著升高（P<0.05）。表明CB通过活化β-catenin信号通路缓解致病菌引起的猪肠上皮细胞损伤；（2）与对照组相比，DMSO组各时间段NF-κB、ZO-1、Occludin、TNF-α、IL-8和LDH含量变化差异均不显著（P>0.05），抑制剂组各时间段NF-κB含量均极显著降低（P<0.01），紧密连接蛋白ZO-1、Occludin、TNF-α、IL-8和LDH含量变化差异均不显著（P>0.05），DMSO+ETEC组、DMSO+SC组各时间段NF-κB、TNF-α、IL-8和LDH含量均极显著升高（P<0.01），紧密连接蛋白ZO-1和Occludin含量均极显著降低（P<0.01）。与DMSO+ETEC组相比，抑制剂+ETEC组和DMSO+CB+ETEC组、抑制剂+CB+ETEC组各时间段NF-κB、TNF-α、IL-8和LDH含量均极显著降低（P<0.01），紧密连接蛋白ZO-1和Occludin含量均极显著升高（P<0.01）。与DMSO+SC组相比，抑制剂+SC组和抑制剂+CB+SC组相关蛋白表达量变化情况与ETEC处理相似。表明，NF-κB信号通路抑制剂和CB都可以降低致病菌诱导的IPEC-J2损伤；（3）与对照组相比，NC组各时间段β-catenin、cyclin D1、c-Myc和LDH含量均无明显变化（P>0.05），si RNA组、si RNA+ETEC组、si RNA+SC组，β-catenin、cyclin D1和c-Myc含量均极显著降低（P<0.01），LDH含量均极显著升高（P<0.01）。与NC+ETEC组相比，si RNA+ETEC组β-catenin、cyclin D1和c-Myc含量均极显著降低（P<0.01），LDH含量均显著增加（P<0.01，P<0.01，P<0.05），si RNA+CB+ETEC组β-catenin、cyclin D1和c-Myc含量均极显著降低（P<0.01），LDH含量18h时极显著降低（P<0.01），NC+CB+ETEC组β-catenin、cyclin D1和c-Myc含量均极显著升高（P<0.01），LDH含量均极显著降低（P<0.01）。与NC+SC组相比，si RNA+SC组、si RNA+CB+SC组和NC+CB+ETEC组相关蛋白表达量变化情况与ETEC处理相似。表明，β-catenin信号通路下调可以加重致病菌造成的IPEC-J2损伤，CB可通过上调β-catenin信号通路缓解这种损伤。
综上所述，从仔猪粪便分离得到的CB可以抑制ETEC K88和SC的生长，并可通过黏附到猪小肠上皮细胞抑制致病菌的黏附，降低其致病性，而且还可以调控NF-κB和β-catenin信号通路关键蛋白的表达，缓解由ETEC K88和SC感染引起的细胞损伤，为丁酸梭菌在仔猪日粮中的应用提供理论依据。