【摘 要】
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该研究以β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase,β-Gal)为目的蛋白,观察TaT蛋白介导其通过BBB到达缺血灶的情况.第一阶段:构建TaT-β-Gal融合基因的细菌表达子及纯化TaT-β-Gal融
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该研究以β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase,β-Gal)为目的蛋白,观察TaT蛋白介导其通过BBB到达缺血灶的情况.第一阶段:构建TaT-β-Gal融合基因的细菌表达子及纯化TaT-β-Gal融合蛋白.首先,合成编码TaT蛋白的DNA,将DNA片段插入pET28a质粒的NheI位点,构成新质粒pET28TaT,用BamHiI和XhoI消化pcDNA4/Myc-His/LacZ质粒得到编码LacZ的DNA,将LacZ的DNA插入到pET28aTaT,最后得到pET28a-TaT-LacZ质粒,转染大肠秆菌BL21(DE3),然后培养细菌,用鳌合金属亲合层析法纯化蛋白.动物实验中发现:腹腔注射urca-denaturedTaT-β-Gal小鼠,于2h后脑组织各个区域均有呈色反映,8h时达高峰.而腹腔注射naturedTaT-β-Gal小鼠,3Omin后即可见呈色反映,于4h时达高峰.腹腔注射β-Gal、生理盐水组于备时间段无呈色反映.4组小鼠的脑切片在脑组织各个区域x-Gal染色前均未见Evans蓝.大鼠MCAO后2h,再灌注后腹腔注射natured TaT-β-Gal融合蛋白,3Omin后即可在缺血灶区检测到β-Gal的活性.2h后即有根强的活性,4h达高峰,腹腔注射β-Gal,各时间段缺血灶区未检测到β- Gal的活性.3组大鼠的脑切片在脑组织各个区域,x-Gal及TTC染色前均未见Evans蓝.结论:TaT蛋白能有效地介导生物活性蛋白通过BBB进入缺血灶区在脑组织中达到有效浓度.
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