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目前,食用菌外源基因表达系统尚不完善,缺乏有效的启动子是导致食用菌转化效率低、外源基因表达水平不高的主要原因之一。因此,从不同种类的食用菌中分离强启动子并对其功能活性进行检测,以期获得功能活性强的启动子,将为完善食用菌外源基因表达系统提供必要的顺式元件。
本实验从香菇(Lentinusedodes)的菌丝中克隆的gpd~ras启动子片段以及从灰树花(Grifolafrondosa)菌丝中克隆的gpd启动子片段分别串联于报告基因gfp上游,构建3个启动子功能活性检测表达质粒pLg-g~v(含香菇gpd启动子)、pGg-g/~(含灰树花gpd启动子)和pLr-gfp(含香菇ras启动子)。
以色氨酸营养缺陷型为筛选标记,通过PEG介导将启动子功能活性检测质粒pLg-gfp,pGg劝,pLr-gfp分别与辅助质粒pCcl001共转化色氨酸营养缺陷型灰盖鬼伞菌株LT2粉孢子原生质体。共转化之后,经过选择培养基筛选,分别获得19个、18个、22个色氨酸营养恢复型(trp+)的假定转化子。
通过PCR方法检测假定转化子中的g/p基因,结果表明:3类转化子中分别有13个、12个、15个为共转化子,其共转化率分别为68.4%,67.8%和68.2%。
利用荧光显微镜对所有trp+转化子进行荧光检测,结果表明:19个pLg-gfp的转化子中有6个能够检测到绿色荧光蛋白的表达;18个pGg-gfp的转化子中有4个能够检测到绿色荧光蛋白的表达;而22个pLr-g)~转化子全部没有检测到绿色荧光蛋白的表达。
以gfp基因为探针的Southern杂交分析结果显示:能够观察到绿色荧光的10个转化子基因组中全部整合了gfp基因,没有观察到绿色荧光的2个pLg-g~转化子、2个pGg-g/p转化子和7个pLr-g~转化子基因组中也有g/p基因的存在。并且在经Southern杂交检测的21个转化子中,gfp基因大多以多拷贝、随机的方式整合在基因组中。
综合分析Southern杂交和各类转化子中绿色荧光蛋白表达检测的结果,我们判定:本试验中的香菇和灰树花gpd启动子片段在灰盖鬼伞中具有启动子功能活性,而香菇ras启动子片段则不具有启动子功能活性或活性很低。