论文部分内容阅读
背景和目的： 脑梗死是目前严重危害人类健康的疾病之一。脑梗死的病理生理过程复杂，氧化应激是最重要的环节。脑梗死后释放大量的自由基，激活小胶质细胞，活化的小胶质细胞是自由基及炎症因子的主要来源。自由基损伤蛋白质、DNA及神经元。目前对其治疗除超早期的溶栓外，尚缺乏其他有效的治疗手段。众多研究提示干细胞移植可能会为脑梗死的治疗提供有效途径。骨髓单个核细胞(Bone marrow mono nuclear cells，BMMNCs)是由造血干细胞、间充质细胞、内皮祖细胞等多种细胞组成的混合细胞群。因其取材方便、可自体移植等优点，已被广泛用于心肌缺血、糖尿病足、脑梗死等缺血性疾病的基础研究和临床实验中。因此，本研究拟通过观察同种异体骨髓单个核细胞移植对小鼠脑梗死体积、神经功能;小胶质细胞的活性;自由基导致的DNA、蛋白质和神经元的损伤的评估;评价骨髓单个核细胞移植对脑梗死后氧化应激的影响，为发现缺血性脑血管病有效治疗手段提供一定的基础研究依据。 方法： 1.BMMNCs的标记与提取方法:供体小鼠经连续腹腔注射BrdU(50mg/kg/day,14day)标记BMMNCs;梯度离心法分离标记的BMMNCs。 2.实验动物及分组:SPF级雄性昆明小鼠(体重25～30g)，随机分为①假手术组②PBS治疗组（PBStreatedgroups）③BMMNCs治疗组（BMMNCstreatedgroup）。 3.大脑中动脉梗死模型制作、细胞移植及检测指标:采用线栓法制作小鼠大脑中动脉梗死（middle cerebr alartery occlusion，MCAO）动物模型;梗死后6h，经尾静脉移植BMMNCs;脑梗死后1d、4d、7d，应用神经功能损伤评分量表（modified Neuro logical Severity Scores，mNSS）评价神经功能缺损症状的改善情况;脑梗死后7d应用TTC染色评估脑梗死的体积;脑梗死1d、4d，应用免疫荧光技术检测移植BMMNCs在脑内分分布;脑梗死1d、4d、7d，免疫荧光检测DNA损伤（8-OHdG标记DNA损伤）、小胶质细胞的活化，OxyBlot评估损伤的蛋白质，FJB检测神经元的变性死亡。 4.统计学方法:数据用x±s表示，应用SPSS17.0软件进行统计学处理，mNSS评分应用重复测量及多变量方差分析，其余数据应用单因素方差分析，P＜0.05差异有统计学意义。 结果： 1.MCAO术后6h，经尾静脉注射5×106BMMNCs。免疫荧光显示，梗死后，移植骨髓单个核细胞可迁移至缺血区域。 2.BMMNCs移植能明显促进神经功能恢复并减少脑梗死体积。mNSS评分显示，脑梗死小鼠均有不同程度的神经功能缺损，BMMNCs治疗组小鼠mNSS评分明显低于PBS治疗组，说明BMMNCs可促进神经功能的恢复，且在第4d时神经功能恢复明显。脑梗死后7d，TTC染色显示BMMNCs治疗组梗死体积较PBS治疗组明显减少，差异有统计学意义(P＜0.05;n=12)。 3.BMMNCs移植抑制小胶质细胞的活化。免疫荧光显示，脑梗死后颅内小胶质细胞均有不同程度的活化，且在第4d活化最明显。脑梗死1d，各组间活化的小胶质细胞无统计学差异，脑梗死后4d和7d，BMMNCs治疗组小胶质细胞活化数量明显低于PBS治疗组，差异有统计学差异(P＜0.05，n=12)。 4.BMMNCs移植抑制DNA和蛋白质的损伤。脑梗死后释放大量的自由基，损伤DNA和蛋白质。脑梗死后4d、7d，BMMNCs治疗组DNA和蛋白质的损伤显著减少，差异有统计学意义(P＜0.05，n=12)。 5.BMMNCs移植抑制神经元的变性死亡。免疫荧光显示，脑梗死后颅内神经元均有不同程度的变性死亡。脑梗死后1d，各组神经元变性死亡无统计学差异;脑梗死4d、7d，BMMNCs治疗组显著抑制神经元的变性死亡，差异有统计学意义(P＜0.05,n=12)。 结论： 1.BMMNCs移植可分布在缺血半暗带区。 2.BMMNCs移植促进脑梗死缺损神经功能的恢复，并减少脑梗死的体积。 3.BMMNCs移植抑制脑梗死后小胶质细胞的活化。 4.BMMNCs移植抑制脑梗死后氧化应激的损伤作用。 5.BMMNCs移植抑制脑梗死后神经元的变性死亡。