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水稻是全球三大粮食作物之一,全世界约一半的人口以其为主食,给全球经济带来巨额效益。我国作为水稻主产国,在亚洲及其周边地区有着非常重要的战略地位。在耕地日益减少的情况下,育种家们在提高水稻产量、改善米质、增强逆境抗性等方面采用了各种方法,其中见效最快的是转基因技术。随着全球变暖,环境温度的升高,对水稻的正常生长带来危害。因此通过转基因技术将耐热基因转入到生产上常用的水稻品种中,对提高水稻耐热能力,保持水稻高产稳产具有重要的生产利用价值。
BnTR1基因是从甘蓝型油菜中克隆的一个与atp6有相互作用的基因,可提高植物耐热性(在转基因油菜中已被证明)。而高温胁迫可直接导致水稻减产,将BnTR1基因转入籼稻品种,提高其对高温胁迫的耐受性,为高温条件下水稻安全生产创制育种新材料。本实验通过农杆菌介导的转化,分别用四个载体Pzh01-TR1、pSB130-35S-TR1、pCambia-35S-TR1和pCambia-35S-TR1-EPSPs,以幼胚和成熟胚作为外植体诱导的愈伤组织作为转化受体,将BnTR1基因分别转入籼稻恢复系R527、保持系D62B,获得转BnTR1基因的再生植株。同时针对本实验中所用到的籼稻材料,进行了转化条件的优化和改进,初步建立了一套适合这些材料的遗传转化体系:
1.总体上讲,成熟胚作为外植体比幼胚更为合适,其操作简单、不受季节限制、污染少;而幼胚费时费力、污染严重、取材仅限于水稻开花后12-15d的颖果。
2.适合籼稻愈伤组织诱导的2,4-D浓度为2.5mg/L,此浓度下出愈率较高,达到80％以上,且愈伤组织干燥致密,呈颗粒状,颜色淡黄。
3.适合籼稻筛选抗性愈伤的潮霉素浓度为40-50 mg/L,品种之间略有差异;实验中R527选用40 mg/L,D62B选用50 mg/L,且经过多次筛选之后,抗性愈伤组织分化能力增强。
4.4个载体转化R527获得的再生植株经PCR检测,转Pzh01-TR1载体检测到18株呈阳性,转pSB130-35S-TR1载体有24株,转pCambia-35S-TR1-EPSPs载体有16株,转pCambia-35S-TR1载体尚未检测到阳性。
5.4个载体的转化效果差异不明显,说明载体种类与转化效率之间没有必然联系。其中pSB130-35S-TR1的筛选率较高,为50.61％,但出苗率偏低,只有12.29％;而pCambia-35S-TR1-EPSPs的筛选效果较差,筛选率为12.90％,出苗率相对略高,为71.25％,因此两者最终转化结果无明显差异。
6.标记基因hyg在T1代中的遗传分离比接近3∶1,符合孟德尔单基因遗传规律,可推测其可在水稻中稳定遗传表达。