论文部分内容阅读
前言 膀胱癌为泌尿系统最常见的恶性肿瘤。到目前为止，对于导致膀胱癌变的细胞和分子机制仍然不十分清楚。越来越多的证据表明，致癌作用的发生必须是调控基因突变的积累，包括癌基因的激活和抑癌基因的失活或缺失。在众多的候选基因中，p53基因被认为是基因组的主要保护基因。最近发现了一个新的与p53有明显同源家族性的基因，且命名为p73（Kaghad等1997）。p73定位于1号染色体短臂。最近文献报导，p73基因可以激活P53的靶基因，包括p21Wad基因，导致细胞凋亡。但p73基因在人类肿瘤中无明显的突变，这与经典的抑癌基因不同。最近Mai等发现在肺癌中p73沉默的等位基因被激活，且野生型p73过度表达，而且在不同肿瘤中有明显的表达差异，提示p73的作用或许具有组织特异性。到目前为止还没有文献报导，p73在膀胱癌中的表达及其在膀胱癌中与凋亡表达的相关性。本实验用免疫组化法及末端酶标记技术（TUNEL），研究P73、凋亡在膀胱癌中的表达及其相关性、及与膀胱癌临床分期，病理分级之间的关系。 实验材料 1．材料：收集中国医科大学第一临床学院泌尿外科2000年3月～2001年4月期间，住院行TUR-Bt，膀胱部分切除及全切的新鲜癌组织标本，液氮冷冻，-70℃冰箱保存。全部患者术前均未行放疗、化疗及生物治疗，术后定期常规膀胱灌注（丝裂霉素）。全部标本均经病理科医生复查、证实诊断。其中男性34例（77％），女性10例（23％）。TUR-Bt22例，膀胱癌部分切除16例，膀胱全切6例。年龄32～79岁，平均55岁，均为膀胱移行细胞癌。病理分期：表浅性膀味移行细胞癌11例，浸润性膀航移行细胞癌33例。按WHO分级：I级17例，11级13例，皿级14例。全部病例均经随访。随访时间从术后当日起至2002年3月（平均18个月入选择8例正常膀施粘膜做正常对照。所有标本均经OCT包埋，连续切片厚度为spin，10％福尔马林或丙酮固定。 Z试剂：兔抗人p73多克隆抗体，工作浓度1：5山S－P试剂盒；DAB显色剂及凋亡试剂盒均为 Santa Cruz公司产品，以上均购自北京中山生物技术有限公司。 实验方法 1．HE染色：所有标本组织均作 HE染色。 2．采用免疫组织化学 S－P法进行组织染色检测 p73蛋白 步骤：冰冻切片，丙酮固定 10分钟，PBS洗三次，滴加 3％Hp卜孵育5分钟，PBS洗三次，加10％正常山羊血清，室温十分钟，去血清滴加稀释一抗厂：5N，37℃孵育二小时，朋S洗三次加二抗孵育＊分钟，mS洗3次，辣根酶标记的链酶卵白素37℃孵育 10分钟，PBS洗3次，DAB显色，自来水充分冲洗，苏木素复染，透明封片。 3．采用：末端原位标记uOD法亲和素辣根过氧化物酶法） 步骤：冰冻切片，10％中性福尔马林室温固定25分钟，PBS洗三次，放人 3％Hp。孵育 10分钟，PBS洗三次，放人 0．2％Titon－X一 液中，室温5分钟，蒸馏水洗样片3次，加标记缓冲液，室温15分钟，去掉，将TdT及Diction一二一dUTP及标记缓冲液混合液（1：1：8）力人，37℃孵育 60分钟，2 X SSC浸泡 15 分钟，PBS洗片 3次加封闭液，孵育 30分钟，去掉，加人 Avidin－HRP作液，37℃孵育60分钟，PBS洗三次，DAB显色，苏木素复染，透明封片。 4．对照 ·2· 门)阴性对照以 PBS代替一抗，及以 PBS代替 TdT，Biotion－11－dUTP及标记缓冲液混合液 问)阳性对照：已知 P73染色阳性的肺癌组织切片及经 DNase处理过的肺癌凋亡阳性片 5．结果判定 P73和凋亡阳性表达均定位于细胞核内，以细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每张切片选取4个高倍视野，每个视野计数 200个细胞，共 800个细胞，以着色细胞数 3 10％为阳性(十人无阳性细胞或阳性细胞数＜10％为阴性(一人凋亡以核内出现棕黄色颗粒为阳性。 6．统计学处理 两组间的比较用 x‘检验；相关性分析用列联表资料 X‘检验，相关系数用Peaxson系数；均数比较用方差分析。 实验结果 一p3蛋白和凋亡在膀航癌组织中的表达 本组 44例膀肤癌标本中，P73染色阳性 24例占 55％，凋亡染色阳性共23例占52％。镜下所见P73、凋亡阳性表达，其核内均呈棕黄色或棕褐色颗粒。P73及凋亡阳性表达均以细胞核为主，8例正常膀脱粘膜 p73、凋亡均无阳性染色。p73及凋亡阳性表达与病理分级之间有显著性差异河＜0．05入… 及凋亡阳性表达与临床分期之间（表浅与浸润癌）之间无显著性差异u＞O．05h凋亡指数与病理分级之间有显著差异河＜O．05h凋亡指数在p 不同表达中有显著差异沙＜0．05人 二、膀脱癌组织中… 与凋亡的相关性分析 p73与凋亡共同阳性表达19例，共同阴性表达16例，凋亡阳性而 p73阴性4例，凋亡阴性而 P73阳性 5例，Person列联系数为0．579，相关性分析P＜o．005，表明膀脱癌组织中p73和凋亡表达 ·3· －——显著相关。 三、随访结果