【摘 要】
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蛋白质和核酸是生命体最为重要的两类生物大分子。基因的表达调控特别是转录调控主要体现为蛋白质与DNA分子间特异性的相互作用。因此,发展有效的DNA.蛋白质相互作用分析技术
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蛋白质和核酸是生命体最为重要的两类生物大分子。基因的表达调控特别是转录调控主要体现为蛋白质与DNA分子间特异性的相互作用。因此,发展有效的DNA.蛋白质相互作用分析技术对于深入理解基因的转录调控机制和发掘新功能基因具有重要意义。
近年来,以生物大分子间亲和力为基础的筛选策略已被广泛应用于鉴定蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA分子间的相互作用。本课题基于募集RNA聚合酶实现转录激活这一基本原理,以商业化的细菌双杂交系统诱饵载体pBT为基础,成功构建了能用于分析蛋白质-DNA相互作用的细菌单杂交(B1H)筛选报告载体pBXcmT,并将其应用于筛选和鉴定与结核分支杆菌毒力基因CFP-10上游调控序列相互作用的潜在转录因子。本研究取得了以下几个方面的研究结果:①以细菌双杂交系统报告菌株总DNA为模板,PCR扩增获得了约1.7 kb的His3-aadA报告基因片段,并进行了测序验证；②将pBT载体中λcⅠ和lac-UV5启动子切除,末端处理后自连环化,然后将上面获得的His3-aadA报告基因片段定向克隆到该载体中构建了初始报告载体pRpb；③为了有效抑制自激活,降低筛选背景,通过构建和筛选部分基因文库,在pRpb报告基因上游成功引入间隔DNA插入片段,经过进一步酶切位点修饰,获得了衍生报告载体pRpb-S7;④构建了包含有两个XcmI位点的媒介DNA片段引入到衍生报告载体pRpb-S7的多克隆位点,成功构建成报告载体pBXcmT,该载体经过XcmI酶切后产生的T-载体可用于目的DNA PCR产物的快速克隆；⑤将结核分支杆菌H37Rv毒力蛋白CFP-10基因上游的调控序列克隆到pBXcmT报告基因His3-aadA上游,产生的重组质粒通过筛选病原菌基因文库,共获得了4个与该调控序列存在相互作用的潜在转录因子。
因此,本研究基于商业化载体pBT成功构建了一个新的细菌单杂交报告载体,该载体不仅无自激活背景,而且在多克隆位点引入了方便的PCR产物克隆策略。与pTRG文库载体配合使用,该系统不仅可以鉴定和发现新的转录因子,而且也能通过已知的转录因子反向筛选其特异识别的DNA靶序列。本研究中新型细菌单杂交系统的构建对于发掘新功能基因及其识别的靶DNA位点具有广泛的应用前景。
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