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一．目的:
许多细胞表面糖蛋白或糖脂是含有岩藻糖(Fucose，Fuc)化的糖链，参与胚胎发育、组织器官形成，并且与肿瘤的生长、浸润有关，如LeY、Lex、sLex等Lewis系血型抗原分子。其中LeY寡糖是一双岩藻糖的寡糖[Fucα1→2Galβ1→4(Fucα1→3)GlcNAcβ1 →R]，在人类70-90﹪的上皮癌中高表达，并与肿瘤细胞的生长、浸润和转移有关，被认为是肿瘤相关的抗原。
岩藻糖基转移酶(FUT)是编码一组催化糖复合物糖链岩藻糖化的酶蛋白，催化糖复合物岩藻糖基化一系列反应的最后一步反应可将L-fucose从GDP-fucose转移至相应受体上形成α1，2，α1，3/4和α1，6连接。到前为止，得到确认的岩藻糖基转移酶基因有13种，其中α1，3岩藻糖基转移酶有六种，包括FUT3，FUT4，FUT5，FUT6，FUT7，FUT9。FUT4(EC．2．4．1．152)主要在白细胞和上皮细胞中表达。FUT4在肿瘤细胞中表达异常，如肠癌、克隆癌、胰腺癌中FUT4明显升高。LeY寡糖的α1，3岩藻糖基化是由FuT4催化完成的。因此，FUT4是LeY寡糖合成的关键酶。
目前，有关FUT4与细胞增殖及凋亡方面的报道甚少。本课题组前期工作表明，LeY寡糖抗原的抗体可抑制细胞的生长，提示FUT4在人上皮癌细胞增殖中发挥作用。
本文旨在通过克隆人FUT4 cDNA、构建其表达载体并将其稳定表达于人表皮癌细胞A431中，观察FUT4基因转染后对A431细胞增殖的变化和对细胞凋亡作用的影响，为进一步探讨肿瘤糖分子病理机制、FUT4对糖抗原合成的调节及FUT4对肿瘤生长凋亡机理的深入研究提供一定理论基础，并为临床治疗LeY阳性表达的肿瘤提供新的思路。
二．方法:
1．从人子宫内膜组织中提取总RNA，利用FUT4全长引物经RT-PCR扩增FUT4 cDNA(1218 bp)片段，克隆至pEGFP-N1表达载体上，经转化、抗生素初步筛选、限制性内切酶酶切鉴定和测序获得重组质粒pEGFP-N1-FUT4。 2．利用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N1-FUT4转染至人上皮癌细胞A431细胞中，经G418筛选后RT-PCR、Western blot和流式细胞技术分析鉴定，获得稳定表达细胞株(A431-FUT4)。
3．采用细胞免疫组化方法和流式细胞技术检测LeY的合成。
4．MTT法检测FUT4对A431细胞生长和增殖的影响，利用软琼脂克隆形成实验观察细胞增殖的变化，流式细胞技术分析FUT4稳定表达细胞株的细胞周期变化。
5．Hoechst33342染色分析和Annexin V/PI流式细胞技术检测FUT4过表达对细胞凋亡的影响。
6．通过对FUT4基因和蛋白的生物信息学分析，确定FUT4的催化功能性位点，构建突变重组质粒(pEGFP-N1-FUT4M)，DNA测序加以鉴定。
7．利用脂质体转染法将重组质粒pEGFP-N1-FUTM4转染至A431细胞中，经G418筛选，获得稳定表达突变FuT4的细胞株(A431-FUT4M)。
8．采用．DNA Ladder和Annexin V/PI流式细胞技术检测突变FUT4对细胞凋亡的影响。
三．结果:
1．利用RT-PCR从人子宫内膜组织总RNA中成功克隆出1218 bp的FUT4 cDNA，重组阳性克隆经酶切和测序鉴定证实目的基因正确插入pEGFP-N1表达载体中，并与载体上的GFP基因处于同一开放阅读框，即pEGFP-N1-FUT4。
2．利用脂质体转染方法，G418筛选获得两个稳定表达外源FUT4的A431细胞株(A431-FUT4-1和A431．FUT4-2)。
3．经RT-PCR、Western blot和流式细胞技术证实外源FUT4基因转染后FUT4表达增加。免疫细胞化学结果表明，FuT4在细胞浆中表达。
4．FUT4转染组细胞LeY合成较转染空载体对照组细胞LeY的合成水平明显增加。
5．MTT细胞生长曲线实验结果显示，与转染空载体组细胞(A431-vector)比较，A431-FUT4组细胞增殖能力明显增高(p<0.05)；在软琼脂中的集落形成数显著增加(p<0.01)；细胞周期分析中A431-FUT4组细胞S期明显增多(p<0.05)。
6．与转染空载体组细胞(A431-vector)比较，A431-FUT4组细胞的细胞凋亡程度下降，Hoechst 33342染色分析A431-FUT4组细胞的细胞凋亡数减少， Annexin V/PI流式细胞技术检测细胞凋亡百分数也出现明显减少(p<0.05)。 7．通过对FUT4基因和蛋白的生物信息学分析，确定FUT4突变位点为Tyrl04，将其突变为苯丙氨酸，利用定点突变试剂盒获得突变质粒pEGFP-N1-FUT4M，DNA测序正确。
8．利用脂质体转染方法，G418 筛选获得两个稳定表达外源突变FUT4的 A431 细胞株(A431-FUT4M1 和 A431-FUT4M2)。
9．A431-FUT4M细胞与转染空载体组细胞和过表达细胞相比，凋亡程度明显增加，DNA分析出现特征性凋亡DNA梯状带，Annexin V/PI流式细胞技术检测细胞凋亡百分数明显升高(p<0.05)。
四．结论: 1．获得稳定表达FUT4的A431细胞株。
2．FUT4在稳定表达的细胞株中表达增高，定位在细胞浆中。
3．FUT4过表达的细胞株促进LeY糖抗原的合成。
4．FUT4过表达能促进肿瘤细胞的生长。
5．FUT4过表达使细胞凋亡程度明显下降。
6．构建突变FUT4的真核表达载体pEGFP-N1-FUT4M，并获得稳定表达细胞株。
7．稳定表达突变FUT4的细胞株具有诱导细胞凋亡增加的作用。