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种子萌发是指从干种子吸水开始到胚根突破外种皮和胚乳的过程。外种皮作为种子外部保护结构在种子萌发过程中起着重要作用,外种皮能够通过机械作用限制胚根的突破或者阻碍水分和氧气的通透来影响种子的萌发。本文通过启动子分析和超表达以及RNAi的方法对GASA10基因在外种皮中对种子萌发的影响进行了研究,获得主要结果如下:
1,通过启动子驱动报告基因GUS的方法,发现GASA10基因在成熟种子外种皮的表皮层表达,越靠近种孔处表达越强,并且在种子吸胀早期表达逐渐减弱。胚和胚乳中均未检测到GASA10基因的表达。通过构建35S∷GASA10-EGFP载体并转化野生型拟南芥,观察根尖细胞中GASA10-EGFP的亚细胞定位情况。实验结果初步确定GASA10-EGFP融合蛋白定位于细胞壁以及胞外基质区域。
2,表型分析发现,超表达GASA10不影响拟南芥幼苗的生长以及开花；但对种子萌发有明显影响。与野生型(Col)相比,GASA10超表达种子萌发受到抑制,连续光照培养24小时左右超表达种子萌发率和野生型种子差异达到最大。
3,将超表达GASA10植株与野生型植株杂交后,对杂交子一代种子萌发进行观察,发现,母本为野生型的种子萌发率与野生型相似,而母本为GASA10超表达的种子萌发率与GASA10超表达的相似,萌发率降低。说明遵从种皮母系遗传规律。因此初步推测超表达GASA10通过抑制外种皮开裂从而推迟种子萌发。以下几个实验进一步证明了我们的推测:1)超表达GASA10种子外种皮开裂率较野生型低；2)通过RNAi的方法下调GASA10的转录水平,发现GASA10的表达量降低后,种子外种皮开裂速率加快；2)去除包裹在胚周围的外种皮和胚乳之后,GASA10基因超表达种子的胚轴伸长速率和野生型无显著差异,说明GASA10基因不影响萌发过程中胚轴的伸长；4)pH3.0 MS液体培养基处理条件下,外种皮中GASA10的表达受到抑制,GASA10超表达抑制种子萌发减弱；5)如果将野生型种子置于pH3.0的MS培养基中,萌发速率比对照(pH5.7)更快。
总之,通过实验,我们已经初步对拟南芥GASA10基因功能进行了阐述:GASA10为分泌型蛋白,定位于细胞壁以及胞外基质区域,GASA10在种子外种皮的表皮层表达,通过抑制外种皮的开裂从而推迟种子的萌发。