蛹虫草和蝉花组氨酸激酶基因的表达以及蛹虫草组氨酸激酶蛋白检测

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组氨酸激酶是双组份系统的重要部分,而双组份系统是真菌感受外界刺激的重要机制,它使真菌能适应和应答环境的改变。蝉花和蛹虫草是传统的药食两用真菌,通过对其组氨酸激酶基因的研究,在理论上比较同为它们的组氨酸激酶基因的表达调控差异。  根据已知的蛹虫草组氨酸激酶基因(CmHK)的序列来设计引物,对蝉花组氨酸激酶基因 IcHK进行克隆,克隆获得的序列经过测序、比对,最终获得了IcHK基因的开放阅读框(ORF)序列,全长为2811bp。对序列进行分析表明,IcHK基因可编码963个氨基酸残基,它的翻译产物IcHK有4个HAMP功能域、1个HisKA功能域、1个HATPase_c功能域和1个REC功能域。  长期以来,对组氨酸激酶的研究主要聚焦在它对外界信号的表达调控上,且近年来有关杀真菌剂表达调控的研究颇多。采用实时荧光定量PCR方法研究了三种杀真菌剂(咯菌腈、异菌脲和克菌丹)对蛹虫草组氨酸激酶CmHK和蝉花组氨酶激酶IcHK表达的影响。结果表明,CmHK基因和IcHK基因对这三种杀菌剂的敏感性均有所不同:这三种杀菌剂不能导致CmHK基因的相对转录量明显增加,因此CmHK基因的表达对这三种杀菌剂的影响不敏感;而它们都可导致IcHK基因的相对转录量的增加,说明IcHK基因的表达对这三种杀菌剂的影响都敏感,尤其对咯菌腈和克菌丹更为敏感。  针对已获得的蛹虫草组氨酸激酶基因,设计两种方法来制备抗体,一种方法是通过原核表达CmHK基因的部分序列获得融合表达蛋白,并以此作为抗原制备抗体。依据CmHK基因ORF序列及其功能域分析,将其分为两段(CmHK1和CmHK2)分别设计引物,将PCR获得的CmHK1和CmHK2两个部分序列分别连接表达载体pET-41a(+),最终转化到BL21(Escherichia coli)受体细胞,以构建CmHK1和CmHK2的原核表达系统。利用IPTG诱导融合蛋白的表达,并使用ProteinIsoTM Ni-NTA Resin纯化表达蛋白。纯化的融合蛋白CmHK1和CmHK2作为抗原免疫家兔后获得了两种抗体anti-CmHK1和anti-CmHK2。另一种方法是化学合成CmHK抗原决定簇短肽,偶联载体蛋白后作为抗原制备抗体。化学合成三条短肽HK3、HK4和HK5后,分别与BSA偶联作为抗原制备了三种抗体 anti-HK3、anti-HK4和 anti-HK5。将这两种方法获得的抗体通过Western blotting方法检测CmHK在蛹虫草中的存在形式。Western blotting分析发现只有 anti-CmHK2没有出现特异性条带,其他抗体均有特异性条带出现。在蛹虫草菌丝体中均可检测到两条特异的蛋白杂交带,分别为85 kDa和45 kDa,表明组氨酸激酶CmHK的可能存在形式有85kD和45kD两种。
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