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目的:脓毒症是由感染因素诱发并且以炎性反应为主的综合征,是烧伤、创伤和大手术等的常见并发症。肠上皮屏障能够阻挡微生物、毒素等透过肠壁进入人体内其他组织、器官以及血液循环。肠屏障功能障碍是脓毒症引发多器官功能障碍综合征(MODS)的重要因素。紧密连接蛋白occludin与黏附连接蛋白E-cadherin是肠上皮屏障的主要组成成分。内毒素脂多糖(LPS)通过改变紧密连接蛋白和黏附连接蛋白的正常表达,造成肠上皮屏障通透性增加,引发肠屏障功能障碍。多项研究已经证实氢气对多种脓毒症动物模型具有明确的保护作用,但是其具体机制尚未明确。本实验研究拟运用人结肠腺癌细胞系建立离体人肠屏障功能障碍模型,观察富氢培养液在调节LPS诱发的肠屏障功能障碍中的作用,并深入探讨其相关的作用机制。方法:人结肠腺癌细胞系Caco2复苏后传代培养至第28-35代之间时用于实验。第一部分:建立Caco2细胞单层模型。首先分别采用不同浓度的LPS(1,10,100μg/ml和1 mg/ml)孵育,于不同时间点(0,3,6,12,24,48 h)检测跨上皮电阻(TER)值和异硫氰酸荧光素标记的葡聚糖的渗透系数(PE)。采用CCK-8法测定100μg/ml和1 mg/ml的LPS对Caco2细胞增殖活力的影响。随机将细胞进行分组(4组):对照(control)组、富氢培养液(H2)组、脂多糖(LPS)组和LPS+H2组。按分组处理,于孵24 h时,分别检测TER值和PE。分别于孵育6、12和24 h时,采用Western blot法测定occludin与E-cadherin的表达水平;于孵育24 h时,采用免疫荧光法测定occludin与E-cadherin的分布情况。第二部分:首先按照第一部分的分组方法于孵育24h时,采用GST-Pulldown法测定Caco2细胞中Ras同源家族蛋白A(Rho A)的活性。细胞进行随机分组(5组):control组、LPS组、LPS+H2组、LPS+H 2+Rho A激动剂CN03(LPS+H2+CN03)组、LPS+Rho A抑制剂C3胞外酶(LPS+C3)组。Control组、LPS组以及LPS+H2组处理同第一部分。LPS+H2+CN03组中,于孵育前3 h时加入1μg/ml的CN03。LPS+C3组中,于孵育前1 h时加入2.5μg/ml的C3胞外酶。于孵育24 h时测定肠屏障模型的TER值与PE。分别采用Western blot法和免疫荧光法测定occludin与E-cadherin的表达与分布情况。第三部分:首先按照第一部分的分组方法于孵育24h时,Western blot法测定哺乳动物Diaphanous相关成蛋白1(m Dia1)的表达水平。慢病毒法转染Caco2细胞,对m Dia1进行RNA干扰,并获取稳定转染细胞株。将细胞随机分为5组:control组、LPS组、RNA干扰(si RNA m Dia1)组、LPS+H2组和si RNA m Dia1+LPS+H2组。其中,control组、LPS组和LPS+H2组处理同前;si RNA m Dia1组和si RNA m Dia1+LPS+H2组使用稳定表达m Dia1干扰片段的Caco2细胞。于孵育24 h时测定肠屏障模型的TER值与PE。分别采用Western blot法和免疫荧光法测定occludin与E-cadherin的表达与分布情况。结果:第一部分:与0μg/ml LPS组比较,100μg/ml和1 mg/ml的LPS孵育6-48h的时间范围内,TER值下降且PE均降低升高,趋势呈现出时间依赖性,并且在24 h时变化程度最为明显;100μg/ml LPS对细胞活力无显著影响,而1mg/ml LPS组中细胞活力显著降低。Control组与H2组比较,上述各指标间差异均无统计学意义。与control组比较,在LPS组孵育24 h时肠屏障模型的TER值降低,PE升高;孵育6-24 h时,occludin和E-cadherin的表达均下调;孵育24 h时,occludin和E-cadherin在细胞膜处分布减少,在细胞质中分布增多,“铁丝网”样形态的连续性与完整性破坏。与LPS组比较,LPS+H2组孵育24 h时肠屏障模型的TER值升高,PE降低;孵育6-24 h时,occludin和E-cadherin的表达均上调;孵育24 h时,occludin和E-cadherin在细胞膜处分布增多,在细胞质中分布减少,“铁丝网”样形态的连续性与完整性改善。第二部分:与control组比较,LPS组中Rho A活性升高;与LPS组比较,LPS+H2组中Rho A活性降低。与LPS+H2组比较,LPS+H2+CN03组中TER值降低且PE升高,occludin和E-cadherin表达下调,且分布紊乱。与LPS组比较,LPS+C3组中,TER值升高且PE降低,occludin和E-cadherin的表达上调,分布情况改善。第三部分:与control组比较,LPS组m Dia1表达降低,LPS+H2组m Dia1表达升高。与control组比较,si RNA m Dia1组TER值降低且PE升高,occludin和E-cadherin表达下调,且分布紊乱;与LPS+H2组比较,si RNA m Dia1+LPS+H2组TER值降低且PE升高,occludin和E-cadherin表达下调,且分布紊乱。结论:富氢培养液能够改善LPS所致离体人肠屏障模型的通透性异常增加,并能调节紧密连接蛋白occludin和黏附连接蛋白E-cadherin的表达与分布,体现了肠屏障保护效应,其机制可能与调节Rho A-m Dia1通路的表达水平有关。