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成骨细胞是骨形成的主要功能细胞，在细胞外基质（extracellular matrix, ECM）的合成、分泌和矿化过程中发挥重要作用，可分泌类骨质包被自身从而转变为骨细胞。除了类骨质外，成骨细胞还可分泌基质小泡（matrix vesicles, MV）。MV主要分布在骨、软骨和牙本质的基质中，有膜包被，富含Ca2+和PO43+，内有细小的钙化结晶，富含多种磷脂和蛋白，在骨矿化过程起始阶段起着重要作用。MV可以调节细胞内外基质中的磷酸盐（Pi）和无机焦磷酸磷酸盐（PPi）的比例，促进矿化物形成，一般被认为是钙化的起始部位。在骨矿化过程中，MV中的钙化结晶释放到成骨细胞分泌的类骨质，形成羟基磷灰石（hydroxyapatite, HA）。HA在软骨或成骨细胞的ECM胶原纤维中的沉积，促进了软骨或骨的矿化。对MV表面受体、离子通道和转运蛋白参与矿化进程的研究也发现，MV蛋白可调节细胞内外基质中的Pi与PPi比例，结合钙离子，抑制钙化或充当成核因子，提供HA成核位点，对正常骨矿化进程起到重要作用，其异常则可能导致矿化物聚集或矿化不足。MV蛋白突变可能从无机离子的比例、酶的活性及成核位点的形成等多方面影响矿化，产生不同程度的矿化异常，导致异位矿化或矿化不足类疾病，而这些疾病在临床上是广泛存在的。因此，对MV参与矿化机制的研究具有重要的临床意义和生物学意义，从MV水平寻找调节矿化的调控因子，可能为病理性矿化的机制研究和治疗提供理论基础和临床依据。目前认为，MV对钙化的促进至少有两大作用1）MV酶可以调节细胞内外的Pi/PPi比例；2）MV蛋白质和脂质，包括酸性磷脂，可作为HA沉积形成的初始晶核。目前蛋白质组学研究已发现2000多种与矿化相关的MV蛋白。大量研究表明， MV蛋白缺乏可能与许多罕见的骨骼类疾病的病理矿化进程密切相关，然而绝大对数蛋白在矿化中所起的调节作用目前仍不明确。U2-OS细胞是一种低磷酸酯酶活性、矿化能力缺陷的成骨细胞，而Saos-2细胞是一种具有显著矿化能力的成骨细胞。上述两种细胞均属人骨肉瘤细胞。本实验室分别从矿化诱导的Saos-2细胞和U2-OS细胞的ECM中提取MV，然后进行比较蛋白质组学分析，以期发现差异表达的MV蛋白。目的：培养矿化能力明显差异的骨肉瘤细胞Saos-2和U2-OS，用矿化诱导培养基诱导培养细胞，提取细胞分泌的基质小泡并进行鉴定。比较蛋白质组学分析MV蛋白，寻找骨矿化相关的差异蛋白，为探索MV在矿化进程中的作用提供新的线索。方法：用含10mM β-磷酸甘油、50μg/mLVc的DMEM和Mccoy′s5AMedium诱导培养Saos-2和U2-OS细胞。分别提取Saos-2和U2-OS细胞基质小泡，并通过流式细胞术和电镜技术鉴定所提取的MV，对MV蛋白进行比较蛋白质组学分析；使用MAS3.0分析软件对蛋白质组学分析所得的差异蛋白作进一步分析；筛选出的差异蛋白经western-blotting进行再验证。结果：从Saos-2和U2-OS细胞中均成功提取获得MV。经电镜和流式细胞仪检测，可观察到本实验室所提取的沉淀直径为50-200nm的小囊泡，并且正常的Saos-2和U2-OS细胞以及矿化诱导7天的U2-OS细胞的提取物中均未发现矿化物结晶，而在矿化诱导7天的Saos-2细胞的提取物中存在包含于囊泡中的矿化物结晶。我们对这两种细胞的MV进行蛋白质组学分析，共发现175种骨矿化相关的差异表达蛋白（表达量比值>2），包括89种上调表达蛋白和86种下调表达蛋白（Saos-2/U2-OS）。我们使用MAS3.0在线分析软件对89种上调表达蛋白进行生物信息学分析，发现12例钙结合蛋白，8例参与了骨相关信号转导途径的蛋白。选取蛋白激酶C-α（proteinKinase C α，PKCα）和RAS相关蛋白Ral-A（ras-related protein Ral-A，Rala）两种表达上调的差异蛋白进行western-blotting验证，发现与蛋白质组学分析结果基本一致。结论：诱导矿化7天的Saos-2和U2-OS细胞呈现明显差异的矿化现象，提取的基质小泡经电镜检测发现矿化诱导7天的Saos-2细胞MV中有矿化结节的存在，而矿化诱导7天的U2-OS细胞MV中则未观察到矿化结节的存在。这个结果从一定程度上表明了，MV为成骨细胞骨矿化提供了成核位点，可能是骨矿化的起始位置。对这两种矿化能力有明显差异的成骨细胞MV进行蛋白质组学分析，筛选与矿化相关的差异蛋白，为探讨MV蛋白在矿化过程中所发挥的作用和初步探索MV在骨矿化过程中的作用机制提供了一定的理论基础和实验依据。