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人类免疫缺陷病毒(HIV)自1981年被发现以来，已有不少人死于该病毒的感染，目前全球约有三千多万感染者，且感染人数还在不断攀升，其已严重危害了人类健康，因此研制抗HIV药物一直是一个迫切需要解决的问题。HIV整个复制过程已相当明确，在此基础上已开发出了一些药物用于艾滋病的治疗，如今市面已有抗HIV药物主要针对HIV感染复制过程中的某些蛋白。反复使用抗HIV药物易导致病毒的耐药性，降低疗效，但HIV很难对以宿主蛋白为靶点的抗病毒药物产生耐药性，因此从宿主水平进行药物靶标的筛选对于抗HIV药物的研制将是一个新的研究方向。本研究拟构建基于慢病毒载体的随机shRNA文库及以HIV-1 LTR启动TK自杀基因稳定表达的细胞系，然后将所获得的文库质粒包装成慢病毒后侵染所构建的HEK293/TK稳定细胞系，再加入药物GCV进行加压筛选收集存活细胞，抽提基因组扩增出其中所含的干扰序列，为最终成功筛选出HIV-1 LTR相关宿主因子奠定基础。具体研究结果如下： 将含有19个碱基的绿色荧光蛋白干扰序列的发卡结构退火补平后与合成的接头(Linker)连接，之后将其作为模版进行PCR，将PCR产物酶切后置于载体pLenti-U6中，获得载体pLenti-U6-shRNA，将其包装成慢病毒颗粒，感染产绿色荧光蛋白的HepG2稳定细胞系，采用流式细胞仪对绿色荧光的表达强度进行检测，结果发现绿色荧光表达减弱，表明该载体中U6启动子能正常启动shRNA的表达，也证实这种构建shRNA随机文库方法的可行性。在此基础上，将19个随机脱氧核苷酸代替19个碱基的绿色荧光蛋白干扰序列并按上述方法进行shRNA随机文库的构建，通过电转连接产物获得了含有大约2.5×107个克隆的文库。随机挑取25个克隆进行测序，发现有两个空载体，初步估计所建文库中92％的克隆有外源片段的插入。 以载体puc-18-EGFP-denv为模板从中扩增出HIV-1 LTR片段，以载体HSV-106为模板从中扩增出TK基因片段。将扩增出来的HIV-1 LTR片段以及TK基因片段作为模板进行重叠PCR将两者连接起来。使用StuⅠ和BamHI酶切LIR与TK连接片段，NruⅠ和BamHI酶切pcDNA3.1(+)载体，使用T4 DNA连接酶将片段与载体连接起来构建成最终HIV-1 LTR调控TK基因表达的载体pcDNA3.1-LTR+TK。使用Lipofectamine2000转染试剂将载体pcDNA3.1-LTR+TK转染HEK293细胞并加入终浓度为800μg/mL的G418进行加压筛选获得稳定表达TK基因的细胞系HEK293/TK，通过倍比稀释法获得稳定表达单克隆，Western Blot与RT-PCR结果显示TK基因能够在HIV-1 LTR的调控下进行表达。 将所获得的文库质粒包装成慢病毒后侵染所构建的HEK293/TK稳定细胞系，病毒侵染48小时后加入终浓度为1.45μg/mL的药物更昔洛韦(GCV)进行加压培养，在此过程中大部分细胞发生死亡，定期更换新鲜培养液，经过约2个月的时间收集到加药后存活下来的细胞，抽提细胞基因组，采用巢式PCR扩增目的干扰序列并用Western Blot对干扰序列进行验证，发现有一个克隆N-5其表达的shRNA能对TK基因的表达起到抑制作用，通过测序获得其中含有的干扰序列同时对其进行分析，结果显示其并不是针对TK基因本身，该序列很有可能针对HIV-1 LTR某宿主相关因子。