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巨大口蘑(Tricholoma giganteum)是一种具有巨大市场潜力且营养丰富的药食兼用的珍稀食用菌。但由于其菌丝生长速度慢，出菇时间较长，制约了该菇的工厂化与规模化发展；双孢蘑菇(Agaricus bisporus)是目前世界上人工栽培最广泛、产量最高、消费量最大的食用菌，但由于极易失水萎蔫、褐变、开伞、腐烂变质，约束了双孢蘑菇国内外市场的开拓，给双孢蘑菇的贮运保鲜带来很大难度。原生质体融合技术是近些年来迅速发展起来的细胞工程育种新技术，它具有许多常规杂交方法所无法比拟的独到之处。本研究旨在通过对巨大口蘑与双孢蘑菇原生质体进行融合，选育出具有在较短时间出菇的巨大口蘑新菌株。 本研究通过单因素和均匀设计等方法对双孢蘑菇廉价原生质体制备及灭活工艺、巨大口蘑与双孢蘑菇融合工艺进行了优化，获得有优良性状并且与亲本有遗传差异性的菌株6株，采用分子生物学ISSR等方法对其中3株进行了鉴定，同时，还研究了它们的生理、生化特性和生物学特性。主要研究结果如下： 1、对影响双孢蘑菇廉价原生质体制备和再生的条件进行了筛选。结果表明：以菌龄5d的菌丝体为原料，采用7.6％纤维素酶和4%蜗牛酶作为混合酶系，0.6 mol/LKCl与0.6 mol/L的甘露醇以1:1复配作为渗透压稳定剂，在32℃条件下，酶解2.2 h，原生质体释放量达到9.9×106个/mL，双孢蘑菇原生质体最优再生培养基为：马铃薯(浸汁)200 g，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，MgSO40.5 g，蛋白胨3g，琼脂20 g，VB110mg，0.6 mol/L的甘露醇1000 mL，pH7.0，此时再生率达到2.11%，比单一采用溶壁酶价格低一半以上。 2、对双孢蘑菇热灭活和紫外灭活工艺进行了优化。结果表明：双孢蘑菇原生质体热灭活和紫外灭活条件分别为56℃热灭活30 min和15 W紫外灯25 cm辐照18 min，此时双孢蘑菇原生质体的致死率可达100%。 3、应用单因素和均匀设计对影响巨大口蘑与双孢蘑菇原生质体融合条件进行了优化。结果表明：当PEG的浓度为26.17%，融合时间24.4 min，融合温度为30.8℃，Tris添加量为0.016 mol/L，CaCl2添加量为0.014 mol/L，pH值为8.5时，巨大口蘑与双孢蘑菇原生质体的融合率达到最大，为3.87×104。 4、应用生物学和分子生物学方法对融合菌株进行了鉴定。通过融合菌株与亲本生物学特性的研究，获得有优良性状并且与亲本有遗传差异性的菌株6株，采用ISSR技术对其中H49、H99、H100三株融合菌株进行了鉴定，并对它们的生理、生化特性进行了研究。融合菌株从形态学上与亲本菌丝的差异很大，并且菌丝生长速度和液体发酵时间明显短于亲本巨大口蘑，并对其进行了ISSR遗传相关系数和聚类分析；结果表明，H49与巨大口蘑之间的遗传相似系数为0.65，与双孢蘑菇的遗传相似系数为0.47；H99与巨大口蘑之间的遗传相似系数为0.60，与双孢蘑菇的遗传相似系数为0.47；H100与巨大口蘑的遗传相似系数为0.47，与双孢蘑菇的遗传相似系数为0.73，初步说明巨大口蘑与双孢蘑菇融合成功。 5、对融合菌株H49、H99、H100的菌丝生长最适培养基进行了优化。H49菌丝生长最适培养基为：蔗糖1%、蛋白胨1%、酵母膏0.11%、VB110mg/L、轻质碳酸钙0.11%、硫酸镁0.287%、磷酸二氢钾0.1087%；采用该培养基，在pH为6时，融合菌株H49的菌丝生长最快，为0.9812 cm/d。H99菌丝生长最适培养基为：蔗糖1%、蛋白胨1%、酵母膏1%、VB12mg/L、轻质碳酸钙0.55%、硫酸镁0.12%、磷酸二氢钾0.55%；利用该培养基，在pH为10.5时，融合菌株H99的菌丝生长最快，为0.9568 cm/d。H100菌丝生长最适培养基：蔗糖2.2%、蛋白胨0.3%、酵母膏1%、VB14 mg/L、轻质碳酸钙0.3%、硫酸镁0.26%、磷酸二氢钾0.25%；利用该培养基，pH为8.5时，融合菌株H100的菌丝生长最快，为0.98812 cm/d。 6、对融合菌株H49、H99、H100的栽培学特性进行了研究。结果表明：H49、H99、H100在玉米粒培养基中菌丝生长速度最快；菌丝浓密，萌发时间较短。所以选用玉米粒培养基作为融合菌株H49、H99、H100的原种培养基；而融合菌株H49栽培培养基选用60%蔗渣，30%棉籽壳，9%麸皮，0.5%酵母粉，0.3%KH2P04(肥料级)，0.1%MgSO4，0.2%轻质碳酸钙，其出菇时间明显短于母本菌株巨大口蘑。