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帕金森病(Parkinsons disease,PD)是中老年人常见的以黑质部位的多巴胺能神经元变性和路易小体(Lewy body,LB)为主要病理特征的中枢神经系统变性疾病。目前对帕金森病的神经元变性机制并不完全清楚,氧化应激、线粒体功能障碍是其重要机制。多巴胺能神经元的大量变性死亡,是PD发病机制的一个重要环节,其原因是因为它易受氧化应激和炎症反应攻击,但机理并不十分清楚。胶质细胞是参与氧化应激和炎症反应的主要细胞。它在正常情况下能产生神经营养因子,促进神经元的存活,起到神经保护的作用,但在接受免疫/炎性因素等刺激时,又可以产生毒性物质,产生有害的慢性炎症反应,参与神经元的变性。在PD患者尸检以及MPTP、6-OHDA、鱼藤酮等动物模型中均可见胶质细胞的活化增生,但在PD发病机制中的作用尚未阐明。
泛素蛋白酶系统(ubiquitin proteasome system,UPS)功能障碍是PD发病机制中的另一重要环节。Parkin、UEHL-1基因突变是一些家族性PD的发病原因,其发病机制是基因突变导致UPS功能障碍。近来研究发现将蛋白酶抑制剂注射到大鼠黑质或纹状体区能成功建立帕金森大鼠模型。
在黑质致密部立体定向注射蛋白酶抑制剂造成的蛋白酶功能损伤的帕金森动物模型中,既往研究集中在DA神经元的死亡机制上,而对胶质细胞是否参与神经元的变性研究较少。观察这种模型中胶质细胞反应的病理特点如何,是值得研究的问题。
目的：
1.应用蛋白酶抑制剂Lactaystin立体定向注射至黑质致密部,建立帕金森大鼠模型。通过HE染色,观察大体病理变化及是否有嗜酸性包涵体的形成。通过TH免疫组化染色,观察多巴胺能神经元的缺失,进一步对模型进行验证。
2.通过GFAP,BSI-B4染色观察黑质星型胶质细胞和小胶质细胞在应用蛋白酶抑制剂Lactaystin制作的PD模型中的病理特点。
方法：
1.采用立体定向微量注射技术建立动物模型将蛋白酶抑制剂lactacystin 8ug(4ul)、等体积生理盐水(4ul)分别注射到SD大鼠右侧黑质致密部,观察Lactacystin组、生理盐水组及正常组的大鼠自主行为和阿朴吗啡诱导的旋转行为,将Lactacystin组每分钟大于7转的大鼠纳入成功模型组。成功模型组、生理盐水组和正常组动物数量各为6只。
2.形态学检验术后6周处死动物,取脑组织制作石蜡切片。应用免疫组织化学技术进行酪氨酸羟化酶(TH)染色、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、植物凝集素(BSI-B4)染色,观察黑质多巴胺神经元的存活情况；黑质区星型胶质细胞(GFAP)、小胶质细胞(BSI-B4)的阳性细胞分布、数量及细胞形态变化。
结果：
1 行为学观察术后2周,生理盐水组及正常组大鼠未见行为异常。Lactacystin组大鼠出现进行性运动迟缓、少动、震颤、弓背、竖尾巴、对外界刺激敏感。注射阿朴吗啡后,出现向健侧旋转运动。
2.HE染色生理盐水组和正常组大鼠黑质区HE染色可见梭形或多角形神经元细胞沿黑质致密带排列密集,细胞形态正常。模型组大鼠可见损伤侧神经元的减少,细胞胞浆空泡形成,胞核皱缩,胶质细胞增生,嗜酸性包涵体的形成。
3.TH免疫组化染色生理盐水组和正常组黑质TH阳性细胞呈梭形或多角形,排列整齐,染色较深。模型组病变侧黑质TH阳性细胞胞体皱缩,染色浅,数量稀少,比健侧减少90％。
4.BSI-B4凝集素组化染色生理盐水组、正常组GSI-B4阳性细胞在脑内数量较少,稀疏、散在分布。其细胞胞体呈类圆形,分支较少,细长。模型组病变侧黑质致密部BSI-B4阳性细胞明显增加,较均匀整齐密布于黑质致密部,可显现出黑质致密带的条带形状。高倍镜下细胞形态较健侧不同,胞体变大变圆,分支缩短、增厚,着色深。细胞计数结果显示：模型组损伤侧细胞均数为45±6个,对侧为10±2个,生理盐水组双侧分别为14±4,15±5个,正常组为12±3个。经Dunnett-t检验,结果显示模型组损伤侧与健侧,生理盐水、正常组差别具有统计学意义(x±s)(p<0.05)。
5.GFAP免疫组化染色生理盐水组、正常组GFAP阳性细胞在脑内分布密集,黑质区、皮质、海马等部位尤为明显,其细胞胞体较小,分支细长,呈星型。模型组病变侧黑质区细胞数量稍有增加。但出现胞体增大,分支变短,染色变深,形态明显活化的星形胶质细胞。细胞计数结果显示：模型组损伤侧细胞均数为58±12个,对侧为42±8个,生理盐水组双侧分别为45±5,50±9个,正常组为49±6个。经Dunnett-t检验,结果显示模型组损伤侧与健侧,生理盐水、正常组差别不具有统计学意义(x±s)(P>0.05)。灰度分析结果示模型组损伤侧灰度值为111.34±1.25,未损伤侧为125.23±0.98,生理盐水注射侧123.56±1.01,非注射侧130.97±0.86正常组131.25±1.10。经Dunnett-t检验,结果显示模型组损伤侧与健侧,生理盐水、正常组的灰度值差别具有统计学意义(x±s)(p<0.05)。
6.两例成功模型组的大鼠注射部位偏差结果分析：有2只成功模型组大鼠的注射位点并非位于黑质区内,位于内侧膝状体、中脑深核邻近黑质致密部的位置,同样出现阿扑吗啡诱导的旋转行为。黑质部位TH阳性细胞稀少、GFAP阳性细胞出现明显活化,数量稍有增加。BSI-B4阳性细胞细胞活化,数量明显增加。在药物注射点部位(位于内侧膝状体、中脑深核)的周围可见GFAP阳性细胞出现胞体增大,分支变短,染色变深,形态明显活化。BSI-B4阳性细胞的明显活化,数目增多。未见TH阳性细胞。
结论：
1 泛素蛋白酶抑制剂lactacystin可导致DA神经元变性死亡。
2.泛素蛋白酶抑制剂lactacystin可导致黑质区小胶质细胞增生、活化：星形胶质细胞活化。
3 泛素蛋白酶抑制剂lacracystin可能对没有多巴胺神经元的区域的小胶质细胞和星型胶质细胞产生激活作用。