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磷是植物生长发育所必需的大量元素之一,在植物的整个生命活动中发挥着重要作用。由于自身的理化特性,土壤中的磷容易被固定而难以被作物直接吸收利用,导致我国大部分土壤,特别是南方酸性红壤,有效磷含量较低,已经成为限制我国作物产量的主要因素之一。以往的研究表明,提高根系酸性磷酸酶活性是作物适应低磷环境的重要机制之一。本研究以蛋白磷酸酶High halogen acid dehydrogenase 1(HAD1)家族为研究对象,在大豆中克隆了GmHAD1亚家族的四个成员,并对GmHAD1亚家族成员进行了表达模式分析、亚细胞定位分析和蛋白生化特性分析。在此基础上,进一步选取在大豆叶和根受低磷处理显著增强表达的GmHAD1-2为候选基因,研究其控制大豆根系生长和磷吸收效率的生物学功能。主要研究结果如下:1)序列比对分析表明,大豆GmHAD1亚家族具有四个成员,即GmHAD1-2、GmHAD1-4、GmHAD1-6和GmHAD1-7。通过氨基酸序列比对发现HAD1亚家族成员都具有HAD家族特有的三个保守结构域,即位于N端的DxDx(T/V)(保守域I)和含有一个保守的丝氨酸残基(保守域II)、位于C端的K-(x)18-22(GDxxxD)(保守域III)。2)定量RT-PCR分析表明大豆GmHAD1亚家族成员的表达模式受到磷有效性的调控。低磷处理显著增加GmHAD1亚家族成员在两种大豆基因型的叶部和根部的表达,尤其是GmHAD1-2、GmHAD1-4和GmHAD1-7。它们在大豆叶部和根部的表达量均比正常磷处理条件下增加了10倍以上。而且,在低磷处理条件下,GmHAD1-7在磷高效的大豆基因型,BX10的叶部和根部的表达量比在磷低效大豆基因型,BD2的表达量高。3)通过烟草表皮细胞的瞬间表达系统,研究了GmHAD1亚家族成员的亚细胞定位。结果显示,GmHAD1-2、GmHAD1-4、GmHAD1-6和GmHAD1-7主要定位于细胞膜和细胞核。通过大肠杆菌异源表达系统,获得了GmHAD1-2、GmHAD1-4、GmHAD1-6和GmHAD1-7融合GST的纯化蛋白。底物特异性分析结果表明,GmHAD1亚家族成员对酸性磷酸酶底物(对硝基苯磷酸二钠盐)和磷酸化的氨基酸(磷酸化丝氨酸、磷酸化苏氨酸、磷酸化酪氨酸)都具有水解酶活性,说明它们兼有酸性磷酸酶和蛋白磷酸酶的水解酶活性。其中,GmHAD1-2、GmHAD1-4和GmHAD1-7对磷酸化的丝氨酸具有较高的水解酶活性,GmHAD1-6对磷酸化的酪氨酸具有较高的水解酶活性。进一步对GmHAD1-2关键氨基酸定点突变的实验结果表明,第9和11位的天冬氨酸、第257位的丝氨酸对维持GmHAD1-2的水解酶活性具有显著的影响。4)进一步构建了GmHAD1-2启动子驱动GUS表达载体,获得了稳定遗传的拟南芥转基因植株。GUS的活性染色结果表明,与正常磷水平处理相比,缺磷处理显著增强了GmHAD1-2在老叶及根部维管组织中的表达。5)通过大豆复合植株转化法,研究了超量或抑制GmHAD1-2表达对大豆毛根生长和磷吸收的影响。结果表明,超量表达GmHAD1-2显著促进大豆毛根的生长,也显著增加了大豆植株的生物量及全磷含量。而且,抑制GmHAD1-2的表达,大豆毛根的生长受到抑制,也显著减少了大豆植株的生物量和全磷含量。以上结果初步表明了GmHAD1-2兼有酸性磷酸酶和蛋白磷酸酶的生化功能,可能直接参与调控了低磷调控大豆根系生长的的生物学功能。