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Toll样受体(Toll-like receptor,TLRs)通过识别来源于微生物的病原体相关分子模式(Pathogen-Associated Molecular Patterns,PAMPs)以及来源于损伤组织的危险相关分子模式(Damage-Associated Molecular Patterns,DAMPs),介导炎症反应,启动机体免疫应答。TLR3是天然免疫系统模式识别受体TLRs家族的成员,识别双链RNA(double stranded RNA,dsRNA)促进炎症反应发挥抗病毒效应。但近来大量研究提示,TLR3的生物学功能不仅仅局限于促进炎症和抗病毒,还可以启动抗炎信号通路,参与炎症精密调控。本论文前期研究发现,TLR3的配体聚肌胞(Polyinosinic-Polycytidylic Acid,Poly(I:C))可刺激人成纤维样滑膜细胞(Fibroblast-like Synoviocytes,FLS)分泌白细胞介素1受体拮抗剂(Interleukin-1 receptor antagonist protein,IL-1Ra)。IL-1Ra是与炎性细胞因子IL-1竞争结合IL-1R,阻断IL-1的信号转导而发挥抗炎作用。本论文将深入探讨TLR3介导IL-1Ra产生的信号通路,为了解TLR3的生物学功能提供新的视角。同时筛选具有增强IL-1Ra分泌的中药单体或小分子化合物,为化合物的抗炎机制提供更多的理论依据。目的建立TLRs配体刺激细胞表达和分泌IL-1Ra的体外细胞模型,为后续研究开展提供基础;探索TLR3介导IL-1Ra分泌的胞内信号通路,期望能寻找到单独调控抗病毒、抗炎、促炎、效应的信号分子;筛选具有增强TLR3介导IL-1Ra分泌的信号分子的中药单体或具有免疫活性的小分子化合物,进而为全面认识TLR3的生物学功能,合理制订相关炎症性疾病的干预策略提供实验证据。方法第一部分:Poly(I:C)诱导人FLS细胞的IL-1Ra表达及分泌1.采用酶联免疫吸附测定(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)检测TLR1-TLR6配体刺激人FLS细胞24 hr后IL-1Ra的分泌情况,以及Poly(I:C)和LPS在0-100μg作用下,IL-1Ra分泌的剂量效应。2.采用ELISA检测TLR3配体Poly(I:C)刺激多种细胞24 hr后IL-1Ra的分泌情况。3.采用ELISA、实时定量聚合酶链反应(Real Time Quantitative Polymerase Chain Reaction,q PCR)检测Poly(I:C)刺激人FLS细胞0-96 hr的IL-1Ra分泌及表达,确定Poly(I:C)诱导IL-1Ra基因和蛋白水平检测的最佳时间点。采用蛋白质免疫印迹(Western Blotting,WB)检测Poly(I:C)刺激人FLS细胞24 hr后胞内IL-1Ra。第二部分:Poly(I:C)诱导IL-1Ra表达的分子机制研究1.采用RNA干扰(RNA interference,RNAi)沉默TLR3,MDA5,RIG-I;ELISA检测敲降TLR3,MDA5,RIG-I后对Poly(I:C)刺激人FLS产生IL-1Ra的影响;ELISA检测Poly(I:C)刺激TLR3-/-小鼠FLS产生IL-1Ra影响。确定Poly(I:C)诱导FLS分泌IL-1Ra是否通过TLR3活化。2.采用q PCR检测Poly(I:C)刺激人FLS细胞1,3,8,24,48,72或96 hr的IFN-β和IL-1Ra m RNA表达水平;ELISA检测Poly(I:C),IFN-β和/或抗-IFN-βm Ab作用下IL-1Ra的分泌水平;ELISA检测放线菌酮干预Poly(I:C)刺激人FLS细胞的IFN-β,IL-1Ra和IL-6的蛋白质水平,q PCR检测IL-1Ra m RNA表达的相对水平。3.采用ELISA检测BX795或IRF3 si RNA干预对Poly(I:C)诱导人FLS细胞IFN-β,IL-1Ra分泌影响;Poly(I:C)刺激IRF3-/-小鼠FLS产生IFN-β,IL-1Ra蛋白水平;以及阻断其他细胞IRF3信号后,IL-1Ra的蛋白水平。4.采用WB,ELISA检测通过小分子化合物或RNAi技术阻断的NF-κB,PI3K-Akt,GSK3β,ERK-MSK,p38-MAPK信号转导对Poly(I:C)刺激人FLS细胞IL-1Ra,IFN-β,IL-6分泌的影响。CCK-8检测细胞的活力。5.采用ELISA检测TLR3-/-和IRF3-/-小鼠体内注射Poly(I:C),其血浆中IL-1Ra的蛋白水平。第三部分:筛选增强IL-1Ra分泌的中药单体及PO-296免疫抑制活性研究1.采用ELISA检测20种抗炎中药单体及苯并恶唑衍生物PO-296对Poly(I:C)诱导人FLS细胞的IL-1Ra和IL-6分泌影响。2.采用流式细胞术(Flow Cytometry,FCM)检测PO-296对活化T细胞增殖抑制的IC50,细胞凋亡,细胞毒性,CD25或CD69表达水平以及细胞周期。ELISA检测PO-296对活化T细胞的细胞因子IL-2,IL-4,IL-6,IL-10,IL-17A及IFN-γ分泌的影响。蛋白免疫印迹法检测JAK3-STAT5,p70S6K,Akt,ERK1/2信号转导的影响。3.采用q PCR检测JAK3抑制剂CP690550和PO-296对Poly(I:C)诱导人FLS细胞IL-1Ra m RNA表达影响。结果第一部分:Poly(I:C)诱导人FLS细胞IL-1Ra表达及分泌1.实验观察到TLR1-TLR6的配体中只有Poly(I:C)和LPS可刺激人FLS分泌IL-1Ra,而Poly(I:C)的刺激效应明显高于LPS。同时也观察到Poly(I:C)在25μg/ml的刺激浓度下,能达到很明显的刺激且不影响FLS细胞增殖。因此,后续实验中Poly(I:C)刺激浓度为25μg/ml。2.Poly(I:C)刺激TLR3活化并诱导多种细胞的IL-1Ra分泌结果显示:TLR3介导IL-1Ra分泌受限制于细胞类型,检测到FLS,AC,NPC,PM和DC能有IL-1Ra的分泌,但在T淋巴细胞,B淋巴细胞,DF,BMSC,WI-38,MRC-5,NCI-H358,NCI-H460,SH-SY5Y和BV2不分泌。其中,FLS分泌IL-1Ra的蛋白量相对较高。因此,后续实验中选用FLS细胞研究TLR3介导IL-1Ra分泌的机制研究。3.通过Poly(I:C)诱导人FLS细胞表达IL-1Ra模型的关键条件的实验,确定了IL-1Ra基因水平检测时间点为刺激后24 hr,蛋白水平检测时间点为24 hr-48hr。第二部分:Poly(I:C)诱导IL-1Ra表达的分子机制1.检测TLR3,MDA5和RIG-I基因沉默以及TLR3敲除对Poly(I:C)刺激FLS细胞IL-1Ra分泌影响。结果显示:Poly(I:C)诱导IL-1Ra表达依赖于TLR3活化,但不依赖于MDA5或RIG-I。2.检测Poly(I:C)诱导人FLS细胞分泌细胞因子是否间接影响IL-1Ra的分泌。结果显示:TLR3同时可诱导IFN-β和促炎细胞因子IL-6,且IFN-β表达早于IL-1Ra。但外源性IFN-β仅能刺激细胞分泌少量IL-1Ra,远不及Poly(I:C)刺激的水平,而在IFN-β特异性抗体存在下用Poly(I:C)刺激细胞表达的IL-1Ra的水平没有显著降低。放线菌酮处理FLS后,Poly(I:C)不能刺激FLS分泌IFN-β,IL-1Ra及IL-6,但细胞仍可大量转录IL-1Ra的m RNA,甚至远高于未抑制的细胞。3.检测IRF3基因沉默以及IRF3基因敲除对Poly(I:C)刺激FLS细胞IL-1Ra分泌影响。结果显示:Poly(I:C)诱导IL-1Ra表达依赖于IRF3活化。4.检测NF-κB信号转导对TLR3活化诱导IL-1Ra表达影响。结果显示:BMS-345541影响了Poly(I:C)诱导的NF-κB磷酸化。阻断NF-κB信号转导几乎完全消除了Poly(I:C)刺激的IL-1Ra,IFN-β和IL-6表达。5.检测PI3K-Akt信号转导对TLR3活化诱导IL-1Ra表达影响。结果显示:LY294002阻断了Poly(I:C)诱导的Akt磷酸化。PI3K-Akt信号转导的阻断显著降低了Poly(I:C)刺激的IL-1Ra和IFN-β,而不抑制IL-6的分泌。6.检测GSK3β信号转导对TLR3活化诱导IL-1Ra表达影响。结果显示:SB415286阻断了Poly(I:C)诱导的GSK-3β磷酸化。抑制GSK3β信号转导显著降低了Poly(I:C)刺激的IL-1Ra和IFN-β,而不抑制IL-6的分泌。7.检测ERK-MSK信号转导对TLR3活化诱导IL-1Ra表达影响。结果显示:PD184352阻断了Poly(I:C)刺激的ERK1/2磷酸化。阻断ERK1/2磷酸化可显著增加了Poly(I:C)刺激细胞的IL-1Ra和IFN-β表达,但IL-6的水平没有影响。MSK基因沉默后结果同阻断ERK信号转导一样可显著增加了Poly(I:C)刺激细胞的IL-1Ra和IFN-β表达,但IL-6的水平没有影响。SB747651A阻断MSK1/2下游信号分子CREB和ATF的磷酸化,但不影响Poly(I:C)刺激细胞的IL-1Ra,IFN-β和IL-6表达水平。MSK蛋白抑制剂与基因沉默的结果不一致,可能SB747651A是作用多个蛋白靶点,对MSK抑制效应不如MSK si RNA的特异性高。8.检测p38 MAPK信号转导对TLR3活化诱导IL-1Ra表达影响。结果显示:SB203580阻断了Poly(I:C)诱导的p38 MAPK磷酸化。抑制p38 MAPK信号转导不影响Poly(I:C)刺激的IL-1Ra和IFN-β,但显著降低了IL-6表达。9.检测TLR3-/-,IRF3-/-小鼠注射Poly(I:C)后血浆中IL-1Ra水平情况。结果显示:TLR3-/-和IRF3-/-小鼠体内注射Poly(I:C)后到血浆中IL-1Ra的分泌明显降低。第三部分:筛选增强IL-1Ra分泌的中药单体及PO-296免疫抑制活性研究1.检测20种抗炎中药单体及苯并恶唑衍生物PO-296对Poly(I:C)诱导人FLS细胞IL-1Ra,IL-6分泌影响。结果显示:中药单体药物龙胆苦苷,双醋瑞因和滨蒿内酯能抑制细胞因子IL-1Ra和IL-6的分泌,但这几种药物显著抑制体外培养的FLS活力。木犀草素单独作用细胞时,药物对细胞的毒性不大,但是与Poly(I:C)共同刺激能显著降低细胞的存活率,直接抑制细胞因子IL-1Ra和IL-6的分泌。苯并恶唑衍生物PO-296能促进Poly(I:C)刺激人FLS细胞IL-1Ra的分泌,并且PO-296促进IL-1Ra分泌效应与浓度成正相关。2.探究PO-296抑制T细胞增殖的机制研究。结果显示:PO-296抑制不同方式活化的T淋巴细胞增殖,IC50值均在2μM左右。PO-296在20μM以内不增加活化T淋巴细胞的凋亡,浓度至80μM没有明显的细胞毒性。PO-296在20μM浓度内不抑制活化T细胞表达CD25和CD69。PO-296能阻滞细胞周期于G0/G1期,并随着浓度的提高G0/G1比例增大。PO-296抑制活化促炎因子(IFN-γ,IL-6,IL-17)的产生但不影响抗炎因子(IL-10)的产生且不影响IL-2和IL-4的产生。PO-296显著减少STAT5磷酸化的水平。3.检测JAK3-STAT5信号转导对TLR3活化诱导IL-1Ra表达影响。结果显示:CP690550并不能促进反而抑制了Poly(I:C)刺激的FLS细胞中IL-1Ra的表达。结论Poly(I:C)刺激人FLS细胞分泌IL-1Ra的效应强于LPS,并在多种类型的细胞中诱导IL-1Ra表达,具有组织特异性。Poly(I:C)对IL-1Ra的诱导依赖于TLR3但不依赖于MDA5,RIG-1以及Poly(I:C)诱导的IFN-β和促炎细胞因子。抑制IRF3和NF-κB信号能完全阻断TLR3/IL-1Ra。抑制PI3K-Akt信号显著降低了Poly(I:C)对IL-1Ra的诱导。通过抑制ERK-MSK信号转导可促进Poly(I:C)对IL-1Ra,但p38MAPK信号转导阻断与IL-1Ra分泌无关。TLR3-/-或IRF3-/-小鼠进一步证实了Poly(I:C)对IL-1Ra的诱导依赖于TLR3与IRF3的活化。苯并恶唑衍生物PO-296促进Poly(I:C)对IL-1Ra的信号通路不依赖于JAK3-STAT5信号的抑制,但JAK3-STAT5信号可能调节TLR3介导IL-1Ra的表达。