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牛结核病主要是由牛结核分枝杆菌引起的一种慢性消耗性人兽共患传染病。在奶牛中最为常见，可通过接触及饮用未消毒的牛奶等多种方式感染人，因此牛结核病快速检测方法的研究具有重大公共卫生学意义。为有效防止人和动物之间的相互传染，彻底控制和净化牛结核病，急需开展牛结核病的快速检测方法的研究以及研制开发商品化检测试剂盒。为此，本研究建立了牛结核分枝杆菌的环介导等温扩增(LAMP)快速检测方法，同时应用细菌学检测和PCR方法对其进行了验证，并且通过临床样品的检测对其进行了论证。
本实验将牛结核分枝杆菌标准株先接种于Midddlebrook7H9液体培养基增菌，继之接种于Midddlebrook7H9固体培养基培养。用Ziehl—Neelsen氏抗酸染色法染色，镜检发现细长平直或稍弯曲的抗酸染色阳性(红色)杆菌。根据GenbankTM已发表的MTB MPT83序列设计合成1对特异性的PCR鉴定引物(上游引物TB—F和下游引物TB—R)，以标准牛结核分枝杆菌为模板，用PCR的方法扩增出长度为850bp特异性片断，将其克隆到pMD—18T载体上，重组质粒经PCR鉴定均为阳性。利用PrimerExplorer V4 LAMP专业设计软件(https：//primerexplorer．jp/lamp4.0.0/index．html)，设计两对特异性引物F3/B3，FIP/BIP，以及一对环引物LoopF/LoopB，该组引物扩增区域包含引物TB—F和TB—R扩增区域。对三对引物、MgSO4、Betaine、Bst DNAPoLymerase和dNTP分别进行优化，建立了LAMP检测方法，并对其进行敏感性、特异性和稳定性的试验。牛结核分枝杆菌LAMP检测结果通过琼脂糖凝胶电泳、颜色变化和反应物沉淀等方法来判定。同时运用PCR和LAMP两种方法对有PPD鉴定史的250份(40份为PPD疑似阳性)痰液临床样品进行了检测结果的比较。
实验结果表明，在250份临床采集牛痰液的结核杆菌检测中，其中40份经结核菌素皮内注射检测得到的疑似阳性结果；用引物TB—F和TB—R PCR扩增时，得到33份阳性产物，阳性率为13.2％；用LAMP方法检测，得到40份阳性产物，阳性率为16％。LAMP方法与PCR方法、PPD试验及传统的细菌学检查结果有较高的符合率，具有较高的特异性、敏感性和稳定性。本研究为牛结核病快速检测试剂盒的研制和开发奠定了良好的基础。