【摘 要】
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该研究通过根瘤农杆菌介导的叶盘法将t-PA基因转入烟草,构建了t-PA基因整合于烟草基因组的转基因烟草植株.同时,获得了t-PA与GFP融合表达的转基因烟草植株,通过荧光显微镜即
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该研究通过根瘤农杆菌介导的叶盘法将t-PA基因转入烟草,构建了t-PA基因整合于烟草基因组的转基因烟草植株.同时,获得了t-PA与GFP融合表达的转基因烟草植株,通过荧光显微镜即可在植物生长的任何阶段进行活体筛选和鉴定,建立了快速高效地检测阳性植株的方法,为转基因烟草制备t-PA走向工业化生产奠定了较好的分析鉴定基础.该研究主要做了如下工作:1.按照标准建立烟草组织培养体系.在取材、消毒、灭菌、接种、培养、继代保存、再生转化、快速繁殖、移栽土壤等方面建立一套标准的操作程序,并优化了条件.2.利用该实验室现有的植物表达载体pCAMBIA系列,构建一系列表达载体:pCA1302-tPA、p163CCtPA、pCA1302NS-HtPA和pCA1302NS-tPAH.通过冻融法将载体导入根瘤农杆菌(GV3101)中,制备了含有目的基因的根瘤农杆菌.3.用含目的基因的根瘤农杆菌GV3101通过叶盘法转化烟草W38,培养再生植株.4.转基因烟草植株的鉴定:PCR结合Southern blotting检测t-PA基因的整合:RT-PCR检测基因表达情况;Western blotting和琼脂糖-纤维蛋白板法检测蛋白的表达和活性;此外,对t-PA与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达的再生植株建立了荧光快速检测法.
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