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第一部分：CAV-1在乙肝相关的肝细胞性肝癌中的表达及其与肿瘤血管新生的关系
目的：Caveolae是细胞膜上50-100nm烧瓶样的膜结构，在多种信号途径中起重要调节作用。其主要的结构蛋白为caveolin-1(CAV-1)。近年来大量的研究资料表明：在一些肿瘤中CAV-1呈低表达，但在另外一些肿瘤中CAV-1呈高表达。体外研究表明CAV-1在血管新生中发挥重要作用。CAV-1在肝细胞性肝癌(HCC)中的表达及其与血管新生的关系目前尚未见报道。本研究了解CAV-1在HCC细胞株、HCC组织、非肿瘤肝组织和正常肝组织中的表达，探讨CAV-1在HCC中的表达与微血管密度(MVD)以及患者临床病理指标和预后的关系。
方法：应用RT—PCR方法检测HCC细胞株HepG2和SMMC7721中CAr-1 mRNA的表达。应用RT—PCR和免疫组织化学等方法检测40例HCC组织及对应的非肿瘤肝组织以及6例正常肝组织中CAV-1的表达。行CD34免疫组化分析来计算MVD。分析CAV-1在三种不同组织中的表达差异及其与MVD、临床病理特征和预后的关系。
结果：GAY-1 mRNA在HCC细胞株中呈高表达。GAV-1在正常肝组织、非肿瘤肝组织和HCC组织中的表达率分别为16.7％(1/6)、85％(34/49)和92.5％(37/40)。在正常肝组织CAV-1表达为阴性或表达极低。从正常肝组织(组1)到非肿瘤肝组织为慢性肝炎和肝硬化肝组织(组2和组3)，再到HCC组织，CAV-1表达呈明显增高趋势。在慢性肝炎和肝硬化组织中CAV-1的表达水平明显高于正常肝组织(p＜0.001)，但在慢性肝炎和肝硬化组织中CAV-1的表达无显著差异(p=0.076)。CAV-1在HCC组织中的表达明显高于慢性肝炎和肝硬化组织(p1=0.019，p2=：0.045)，但组2和组3 HCC组织中CAV-1的表达无显著差异(p=0.41)。CAV-1在HCC组织中的表达与MVD呈正相关(rs=0.46，p=0.01)。CAV-1的高表达与肿瘤的转移(p=0.031)和预后(p=0.041)有关。
结论：CAV-1在HCC的进展过程中起重要作用。CAV-1在HCC中的作用与肿瘤的血管新生有关。CAV-1可作为判断HCC预后的因素之一。
第二部分：脐静脉内皮细胞体外三维新生血管模型的建立:
目的：建立基于人脐静脉内皮细胞(HUVECs)和纤维蛋白基质的体外三维新生血管模型。
方法：应用胰蛋白酶消化的方法，从新生儿脐带分离HUVECs，传代纯化并建立稳定的培养体系，用纯化及稳定培养的HUVECs构建体外三维新生血管模型。以1％人纤维蛋白原溶液经凝血酶诱导聚合后作为模型基质，将HUVECs单层细胞接种于纤维蛋白基质中，持续培养5天。连续培养期间每天随机照相，通过Image J分析软件进行定量分析。
结果：分离纯化的HUVECs经免疫组化鉴定纯度接近100％，能稳定传代培养10代以上；三维培养过程中观察到HUVECs伸展、出芽、分枝到毛细管腔样网状结构形成等特征性的血管新生过程，并可进行定量分析。
结论：成功获得了纯化的HUVECs并能稳定培养，同时建立了稳定的体外三维新生血管模型，能很好的模拟体内血管新生的特征性过程，并能进行血管新生的形态学及定量分析，为后续新生血管的相关研究建立了良好的技术平台。
第三部分：CAV-1在脐静脉内皮细胞体外三维新生血管模型中的作用
目的：探讨CAV-1在体外三维血管新生模型中的作用。
方法：将HUVECs种植于三维纤维蛋白凝胶中，在VEGF(20ng/ml)作用培养至5天以形成广泛的毛细管腔样结构，在不同的时间点(0天、1天、3天和5天)用RT—PCR方法来测定CAV-1的表达情况。采用反义寡核苷酸技术来下调HUVECs中CAV-1的表达。分别将转染反义寡核苷酸(ASON)、无义寡核苷酸(NSON)和未转染的HUVECs在纤维蛋白凝胶中培养至5天，观察内皮细胞的出“芽”生长情况，并比较三者管腔形成指数的差别。
结果：培养当天(d0)CAV-1的表达呈阴性。第一天(d1)时可见HUVECs在凝胶中里出“芽”生长，此时CAV-1呈低表达。HUVECs在凝胶中生长至第5天形成广泛的网状结构，此时CAV-1呈高表达。CAV-1的表达呈时间依赖性逐步升高。转染ASON后HUVECs中CAV-1的表达明显降低。将转染ASON、NSON的HUVECs和未转染的HUVECs分别种植于三维纤维蛋白凝胶中，生长至第5天，转染NSON和未转染的HUVECs均能形成毛细管腔样网络结构，而转染ASON的HUVECs只可见散在的管腔样结构，不能形成网络结构。转染ASON的HUVECs在纤维蛋白凝胶中生长5天，管腔形成指数明显低于转染NSON和未转染的HUVECs。
结论：CAV-1在HUVECs体外管腔结构形成过程中起非常重要的调节作用。
第四部分：CAV-1在NO介导的三维血管新生模型中的作用
目的：内皮型NO合酶(eNOS)是一种CAV-1结合蛋白，被证实在VEGF诱导的血管新生中起重要作用。本实验探讨CAV-1/eNOS在NO介导的血管新生中的作用。方法：HUVECs在VEGF的诱导下在纤维蛋白凝胶中培养至第5天。应用半定量RT—PCR的方法来检测CAV-1和eNOS的表达情况。应用反义寡核苷酸技术(ASON)来下调HUVECs中CAV-1的表达。转染ASON和未转染的HUVECs分别在三维纤维蛋白凝胶中培养至第5天，培养液中加入VEGF(20ng/mL)和/或N—硝基—L—精氨酸(L-NAME)(5mmol/L)进行体外干预。用NO测定试剂盒来测定培养液中NO的含量。毛细管腔样结构通过Imagine J软件计算管腔形成指数(TFI)来定量分析。 结果：RT—PCR结果表明：CAV-1的表达呈时间依赖性的逐渐增高，至第5天时达到最高值，但eNOS的表达无明显变化。VEGF(20ng/mL)能够促进NO的产生和毛细管腔样结构的形成。VEGF的这种促进作用能被L-NAME(5mmol/L)所阻止。当转染ASON的HUVECs种植于三维纤维蛋白凝胶中，添加VEGF(20ng/mL)和L-NAME(5mmol/L)不能明显改变NO的产生和毛细管腔样结构的形成。结论：VEGF可促进HUVECs在三维纤维蛋白凝胶形成毛细管腔样结构和NO的产生，NO是一个重要的血管新生促进因子。VEGF和NO必须通过CAV-1才能在血管新生过程中发挥作用。CAV-1可作为抗血管新生治疗的靶点。