倒刺鲃雄激素受体cDNA克隆、序列分析及时空表达

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雄激素(androgens)在脊椎动物性别分化、性腺成熟和生殖行为中扮演着重要角色,而雄激素的作用是通过雄激素受体介导的。本论文克隆了倒刺鲃(Spinibarbusdenticulatus)雄激素受体(androgenreceptor,AR)的全长cDNA,分析了其序列特征,比较了氨基酸序列同源性,并研究了AR的时空表达情况。从倒刺鲃精巢克隆得到的ARcDNA全长3172bp,可读编码框为2595bp,编码865个氨基酸,预计分子量为95.4kDa,理论等电点(pI)为7.13。倒刺鲃AR基因存在高度可变的转录激活结构域(TAD)、高度保守的DNA结合结构域(DBD)和中度保守的配体结合结构域(LBD),与其他硬骨鱼类相比,三种结构域的同源相似性分别为:TAD,12~83%;DBD,73~99%;LBD,65~98%。将倒刺鲃AR的氨基酸序列与其它动物进行同源性比较,并构建进化树,结果显示,倒刺鲃AR与鲤科鱼类中的金鱼(Carassiusauratus)同源性最高,其次是黑头软口鲦(Pimephalespromelas)和斑马鱼(Daniorerio)。组织分布结果表明:AR在雄鱼脑各分区均有表达,外周组织以精巢、肝、脾、肾、头肾、心脏、红肌、白肌和胃的表达水平最高,在皮肤、鳃和脂肪组织也有微量表达;AR在雌鱼的嗅球、端脑、下丘和垂体中有表达,外周组织以肝脏和心脏的表达水平最高,在脾、肾、头肾、红肌和皮肤中有微量表达。运用RT-PCR技术研究ARmRNA在倒刺鲃胚胎发育过程的表达情况,结果显示:AR在受精卵、16细胞期、囊胚中期都有微弱的表达;原肠中期和神经胚期没有表达;表达水平在胚孔封闭期、眼囊期和尾芽期逐渐升高;肌肉效应期表达水平降低,晶体出现期升高,心跳期降低;孵化前期、初孵仔鱼和孵化后4天(4DPH)仔鱼AR的表达水平呈现逐渐升高的趋势。采用组织学方法鉴定脑、垂体、肝和性腺样品所处的性腺发育阶段,然后利用Realtime-PCR技术定量检测脑、垂体、肝、性腺四种组织的AR在倒刺鲃性腺发育早期、性腺发育中期和性腺成熟期的表达水平,结果显示:对于雄鱼,精巢发育早期、中期和成熟期,脑组织AR的相对表达水平存在显著性差异;精巢发育早期和中期,垂体组织AR的相对表达水平显著低于精巢成熟期,早期和中期AR的相对表达水平差异不显著;精巢发育中期和成熟期,精巢组织AR的相对表达水平显著低于精巢发育早期,中期和成熟期AR的相对表达水平差异不显著。精巢发育早期、中期和成熟期,肝脏组织AR的相对表达水平存在显著性差异。对于雌鱼,卵巢发育早期,脑组织AR的的相对表达水平显著低于中期,早期和成熟期AR的相对表达水平差异不显著,中期和成熟期AR的相对表达水平差异也不显著;垂体、卵巢和肝脏组织AR在卵巢发育早期、中期和成熟期的相对表达水平的差异都不显著。结果暗示了雄激素可以通过AR的调节作用,调节倒刺鲃脑和垂体发育成熟及功能的维持,同时也表明了AR在促进精子发生和精子形成、卵黄蛋白原的合成、卵母细胞发育成熟过程中的重要作用。
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