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流行病学研究显示餐后高血糖与糖尿病的发生密切相关。α-葡萄糖苷酶是控制餐后血糖的主要靶酶之一。然而，目前临床使用的α-葡萄糖苷酶抑制剂（阿卡波糖、米格列醇和伏格列波糖）通常会引起胃肠不适、恶心等副作用。因此，开发天然来源且无毒副作用的α-葡萄糖苷酶抑制剂对控制餐后血糖和防治糖尿病具有重要意义。本论文的前期研究表明，浆果花色苷提取物具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，但其具体的构效关系及作用机制尚未阐明清楚。因此，本论文以天然浆果（蓝莓、红树莓、桑葚、蔓越莓、草莓和杨梅）为研究对象，运用制备液相色谱、高速逆流色谱及固相萃取等现代分离纯化技术建立了浆果花色苷的精准制备技术，实现了高纯度花色苷单体的制备，有效解决了花色苷分离纯化难、纯度低等问题。进一步运用荧光光谱、圆二色谱、分子对接和三维定量构效关系（3D-QSAR）等交叉学科技术，系统阐明了浆果花色苷抑制α-葡萄糖苷酶的构效机制。具体结果如下：
1.阐明了浆果花色苷在高速逆流色谱（HSCCC）与液相色谱（HPLC）中的保留特性。研究表明，花色苷在高速逆流色谱中的洗脱顺序主要由其糖苷决定，即糖苷为二糖的花色苷比糖苷为单糖的花色苷先出峰；具有相同糖苷的花色苷紧邻出峰。然而，在液相色谱中，花色苷的洗脱顺序主要由其苷元决定。基于花色苷在高速逆流色谱与液相色谱中保留特性的差异，建立了以高速逆流色谱、液相色谱及固相萃取（SPE）技术为核心的浆果花色苷精准制备技术。运用此技术，从浆果中制备得到18种花色苷单体，包括自然界中6大类花色苷苷元与5大类糖苷，其纯度均大于95%。
2.建立了基于HPLC的α-葡萄糖苷酶活性检测方法，准确测定了18种花色苷单体的α-葡萄糖苷酶抑制活性，发现酶抑制活性与花色苷的苷元和糖苷密切相关，进而提出了花色苷抑制α-葡萄糖苷酶的构效关系。对于具有相同糖苷不同苷元的花色苷而言，其α-葡萄糖苷酶抑制活性的强弱遵循天竺葵素>锦葵素>芍药素>飞燕草素>矮牵牛素>矢车菊素的规律；而对于具有相同苷元不同糖苷的花色苷而言，其α-葡萄糖苷酶抑制活性的大小又符合阿拉伯糖苷>芸香糖苷>葡萄糖苷>半乳糖苷>桑布糖苷的规律。此外，在测定的浆果花色苷中，天竺葵素-3-O-芸香糖苷（Pg3R）的酶抑制活性最强，其IC50为1.69μM，是阳性对照阿卡波糖活性（IC50=356.26μM）的211倍。
3.运用酶促动力学、荧光光谱和圆二色谱技术揭示了花色苷抑制α-葡萄糖苷酶的作用机制。研究表明，代表性花色苷（Pg3R、Pg3G和M3A）能够与α-葡萄糖苷酶形成基态配合物，并以静态猝灭的方式猝灭其内源性荧光，属于混合竞争性抑制剂。圆二色谱结果表明，酶抑制活性较好的花色苷（Pg3R、Pg3G和M3A，IC50<15μM）能够显著减少α-葡萄糖苷酶中α-螺旋结构比例，增加β-折叠结构含量，而活性较差的花色苷（D3S,IC50>4000μM）对酶二级结构的影响不显著。因此，推测花色苷抑制α-葡萄糖苷酶的作用机制可能与其诱导α-螺旋向β-折叠结构转化相关。
4.运用同源建模技术构建了α-葡萄糖苷酶的三维结构。随后以代表性花色苷Pg3R、Pg3G、M3A、Peo3A、D3A、C3G、C3R、D3S和C3S为研究对象，采用分子对接技术从分子相互作用角度进一步阐明了花色苷抑制α-葡萄糖苷酶活性的构效机制。研究表明，活性较好的花色苷（Pg3R、Pg3G、M3A、D3A、Peo3A），其苷元A环和C环能有效插入到酶活性口袋中，并与酶催化活性中心的关键氨基酸残基Glu276、Asp214、Asp349发生相互作用，而活性较差的花色苷，如D3S和C3S，其苷元游离在活性口袋之外，无法与酶催化活性中心的关键氨基酸残基形成相互作用力。基于此，提出了花色苷抑制α-葡萄糖苷酶的构效机制，即花色苷苷元与Glu276、Asp214、Asp349、Tyr71和Ala278关键氨基酸残基形成的氢键、π-anion静电相互作用和疏水相互作用，以及花色苷糖苷与Asp408形成的氢键相互作用会有利于提高花色苷的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
5.以体外酶抑制活性最好的花色苷Pg3R为研究对象，开展降低餐后血糖的动物药效学实验。结果表明，灌胃50mg/kg和150mg/kg的Pg3R能够有效降低小鼠的餐后血糖，且150mg/kg的Pg3R改善餐后血糖效果与50mg/kg的阳性对照阿卡波糖作用效果相当。
6.根据浆果花色苷的结构及其α-葡萄糖苷酶抑制活性，采用CoMFA和CoMSIA方法建立了花色苷抑制α-葡萄糖苷酶的3D-QSAR模型，从花色苷分子的体积场、静电场、疏水场、氢键供体场和氢键受体场的角度，进一步揭示了花色苷抑制α-葡萄糖苷酶的构效关系。研究发现，体积场对花色苷抑制α-葡萄糖苷酶活性的贡献最大，分别为72.2%（CoMFA）和32.5%（CoMSIA）。运用构建的3D-QSAR模型对自然界中472种天然花色苷的酶抑制活性进行预测。结果发现23种天然花色苷的预测IC50值低于1.69μM，即可能具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。其中，19种花色苷为酰化花色苷，包括乙酰化、咖啡酰化、丙二酰化、阿魏酰化和对香豆素化花色苷，酰化部位均位于糖苷处。因此，推测在糖苷处引入酰化基团可能有利于提高花色苷的α-葡萄糖苷酶抑制活性。研究结果为后续从自然界中筛选更多活性较强的花色苷类α-葡萄糖苷酶抑制剂指明了方向。
综上所述，本论文建立了浆果花色苷的精准制备技术，可实现高纯度花色苷单体的制备；系统阐明了浆果花色苷抑制α-葡萄糖苷酶的构效机制，并从浆果中筛选得到一种新颖的α-葡萄糖苷酶抑制剂，即天竺葵素-3-O-芸香糖苷（Pg3R），动物实验证明了Pg3R具有降低小鼠餐后血糖的功效。因此，Pg3R有望成为一种新型的天然来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂，用于控制餐后血糖。
1.阐明了浆果花色苷在高速逆流色谱（HSCCC）与液相色谱（HPLC）中的保留特性。研究表明，花色苷在高速逆流色谱中的洗脱顺序主要由其糖苷决定，即糖苷为二糖的花色苷比糖苷为单糖的花色苷先出峰；具有相同糖苷的花色苷紧邻出峰。然而，在液相色谱中，花色苷的洗脱顺序主要由其苷元决定。基于花色苷在高速逆流色谱与液相色谱中保留特性的差异，建立了以高速逆流色谱、液相色谱及固相萃取（SPE）技术为核心的浆果花色苷精准制备技术。运用此技术，从浆果中制备得到18种花色苷单体，包括自然界中6大类花色苷苷元与5大类糖苷，其纯度均大于95%。
2.建立了基于HPLC的α-葡萄糖苷酶活性检测方法，准确测定了18种花色苷单体的α-葡萄糖苷酶抑制活性，发现酶抑制活性与花色苷的苷元和糖苷密切相关，进而提出了花色苷抑制α-葡萄糖苷酶的构效关系。对于具有相同糖苷不同苷元的花色苷而言，其α-葡萄糖苷酶抑制活性的强弱遵循天竺葵素>锦葵素>芍药素>飞燕草素>矮牵牛素>矢车菊素的规律；而对于具有相同苷元不同糖苷的花色苷而言，其α-葡萄糖苷酶抑制活性的大小又符合阿拉伯糖苷>芸香糖苷>葡萄糖苷>半乳糖苷>桑布糖苷的规律。此外，在测定的浆果花色苷中，天竺葵素-3-O-芸香糖苷（Pg3R）的酶抑制活性最强，其IC50为1.69μM，是阳性对照阿卡波糖活性（IC50=356.26μM）的211倍。
3.运用酶促动力学、荧光光谱和圆二色谱技术揭示了花色苷抑制α-葡萄糖苷酶的作用机制。研究表明，代表性花色苷（Pg3R、Pg3G和M3A）能够与α-葡萄糖苷酶形成基态配合物，并以静态猝灭的方式猝灭其内源性荧光，属于混合竞争性抑制剂。圆二色谱结果表明，酶抑制活性较好的花色苷（Pg3R、Pg3G和M3A，IC50<15μM）能够显著减少α-葡萄糖苷酶中α-螺旋结构比例，增加β-折叠结构含量，而活性较差的花色苷（D3S,IC50>4000μM）对酶二级结构的影响不显著。因此，推测花色苷抑制α-葡萄糖苷酶的作用机制可能与其诱导α-螺旋向β-折叠结构转化相关。
4.运用同源建模技术构建了α-葡萄糖苷酶的三维结构。随后以代表性花色苷Pg3R、Pg3G、M3A、Peo3A、D3A、C3G、C3R、D3S和C3S为研究对象，采用分子对接技术从分子相互作用角度进一步阐明了花色苷抑制α-葡萄糖苷酶活性的构效机制。研究表明，活性较好的花色苷（Pg3R、Pg3G、M3A、D3A、Peo3A），其苷元A环和C环能有效插入到酶活性口袋中，并与酶催化活性中心的关键氨基酸残基Glu276、Asp214、Asp349发生相互作用，而活性较差的花色苷，如D3S和C3S，其苷元游离在活性口袋之外，无法与酶催化活性中心的关键氨基酸残基形成相互作用力。基于此，提出了花色苷抑制α-葡萄糖苷酶的构效机制，即花色苷苷元与Glu276、Asp214、Asp349、Tyr71和Ala278关键氨基酸残基形成的氢键、π-anion静电相互作用和疏水相互作用，以及花色苷糖苷与Asp408形成的氢键相互作用会有利于提高花色苷的α-葡萄糖苷酶抑制活性。
5.以体外酶抑制活性最好的花色苷Pg3R为研究对象，开展降低餐后血糖的动物药效学实验。结果表明，灌胃50mg/kg和150mg/kg的Pg3R能够有效降低小鼠的餐后血糖，且150mg/kg的Pg3R改善餐后血糖效果与50mg/kg的阳性对照阿卡波糖作用效果相当。
6.根据浆果花色苷的结构及其α-葡萄糖苷酶抑制活性，采用CoMFA和CoMSIA方法建立了花色苷抑制α-葡萄糖苷酶的3D-QSAR模型，从花色苷分子的体积场、静电场、疏水场、氢键供体场和氢键受体场的角度，进一步揭示了花色苷抑制α-葡萄糖苷酶的构效关系。研究发现，体积场对花色苷抑制α-葡萄糖苷酶活性的贡献最大，分别为72.2%（CoMFA）和32.5%（CoMSIA）。运用构建的3D-QSAR模型对自然界中472种天然花色苷的酶抑制活性进行预测。结果发现23种天然花色苷的预测IC50值低于1.69μM，即可能具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性。其中，19种花色苷为酰化花色苷，包括乙酰化、咖啡酰化、丙二酰化、阿魏酰化和对香豆素化花色苷，酰化部位均位于糖苷处。因此，推测在糖苷处引入酰化基团可能有利于提高花色苷的α-葡萄糖苷酶抑制活性。研究结果为后续从自然界中筛选更多活性较强的花色苷类α-葡萄糖苷酶抑制剂指明了方向。
综上所述，本论文建立了浆果花色苷的精准制备技术，可实现高纯度花色苷单体的制备；系统阐明了浆果花色苷抑制α-葡萄糖苷酶的构效机制，并从浆果中筛选得到一种新颖的α-葡萄糖苷酶抑制剂，即天竺葵素-3-O-芸香糖苷（Pg3R），动物实验证明了Pg3R具有降低小鼠餐后血糖的功效。因此，Pg3R有望成为一种新型的天然来源的α-葡萄糖苷酶抑制剂，用于控制餐后血糖。