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牛奶因具有极高的营养价值而深受消费者喜爱，但同时也为微生物的生长代谢提供了良好的介质。低温冷链技术能抑制原料奶中微生物的生长，而嗜冷菌在低温下仍能生长繁殖，并逐渐演变成原料奶中的优势菌群。目前，嗜冷菌的分泌耐热腐败酶能力和生物被膜形成能力是制约乳制品行业发展的两大重要因素。虽然嗜冷菌经常规热处理后能被杀死，但嗜冷菌所分泌的耐热腐败酶仍有酶活残留，进而影响乳制品的品质和货架期。生物被膜对乳品行业的危害主要有：食源性疾病的传播、乳制品的腐败变质、对加工设备的损耗及能耗的升高。本论文对我国16个地区/牧场采集的原料奶样品中的嗜冷菌进行分离鉴定，分别从产腐败酶和生物被膜形成两个方面探讨嗜冷菌对乳品工业的潜在危害。同时，探究AHLs信号分子对嗜冷菌生长代谢、分泌腐败酶以及生物被膜形成的调控机制。
采用分离培养结合RAPD-PCR技术，将16个地区/牧场的原料奶样品中的480株嗜冷菌聚类成85个RAPD组，且经16S rRNA鉴定后发现优势菌属依次为假单胞菌属（58.8%）、不动杆菌属（13.3%）、黄杆菌属（6.0%）、鞘氨醇杆菌属（4.2%）和沙雷氏菌属（3.1%）；而在种水平上的优势菌种为Pseudomonas fluorescens（15.8%）、Pseudomonas fragi（7.1%）、Pseudomonas psychrophila（5.4%）、Acinetobacter johnsonii（5%）、Pseudomonas putida（4.6%）和Pseudomonas azotoformans（3.8%）。同种、不同株的嗜冷菌（如P.fluorescens，P.fragi，P.psychrophila等）RAPD分子指纹图谱存在种内差异。此外，Acinetobacter harbinensis，Acinetobacter oryzae等嗜冷菌首次在原料奶中被分离鉴定到。
假单胞菌属、不动杆菌属、黄杆菌属、产吲哚金黄杆菌属、沙雷氏菌属和产气单胞菌属不仅是原料奶中的优势菌属，也是重要的产腐败酶来源，它们在室温和低温下都有较强的产腐败酶的能力。大多数蛋白酶和脂肪酶经热处理（70℃、80℃和90℃）后仍有酶活残留，代表性嗜冷菌株所分泌的蛋白酶和脂肪酶的酶灭活热力学参数也证实这些酶具有较高的热稳定性。嗜冷菌产腐败酶是一个依赖于生长温度的过程，生长温度对其分泌腐败酶的能力影响显著，但对腐败酶的耐热性并无显著影响。
大多数嗜冷菌在低温下（7℃）具有生物被膜形成能力（OD595值的范围为0.087-1.324），72个RAPD组中有25株、10株和19株菌分别呈弱、中等和强生物被膜形成能力，且假单胞菌属菌株的生物被膜形成能力显著强于其它属的菌株。不同培养基对嗜冷菌生物被膜的形成有影响，与脱脂牛奶相比（1.04-6.1log CFU/cm2），嗜冷菌在TSB中更容易在不锈钢表面形成生物被膜（1.15-6.63log CFU/cm2）。96孔板法和不锈钢片表面吸附法这两种方法之间呈现出中等相关性（r=0.42），证明采用这两种方法评估微生物生物被膜形成的可靠性。嗜冷菌的生物被膜形成能力存在异质性，即同种、不同株的嗜冷菌形成生物被膜的能力存在差异。
嗜冷菌之间的相互作用对生物被膜的形成和消毒剂的抗性影响显著。Pseudomonas libanensis能提高Chryseobacterium oncorhynchi和Aeromonas hydrophila生物被膜的形成能力，且P.libanensis与C.oncorhynchi呈协同效应关系。与单一菌落形成的生物被膜相比，二元混合菌生物被膜模型（P.libanensis+A.hydrophila、P.libanensis+C.oncorhynchi）对过氧乙酸、过氧化氢和次氯酸钠这三种消毒剂抗性均显著提高。过氧乙酸对单菌、混合菌形成的生物被膜清除率最高，其次为过氧化氢和次氯酸钠。平板计数法和CLSM观察分析法均能有效评估不同消毒剂处理对生物被膜的影响，这两种方法间相关性好。
采用报告平板法筛选能产AHLs信号分子的嗜冷菌，阳性检出率为71.43%；进一步使用LC-MS鉴定代表菌株P.azotoformans(a)和Serrita liquefaciens产AHLs的种类，发现P.azotoformans(a)产C6-HSL，而S.liquefaciens产C8-HSL。外源性添加C6-HSL和C8-HSL对P.azotoformans(a)和S.liquefaciens的生长、分泌腐败酶以及生物被膜的形成均有显著的促进作用。外源性添加C6-HSL和C8-HSL也加速P.azotoformans(a)和S.liquefaciens对牛奶的腐败作用，其中牛奶的粒径大小显著增大、牛奶中的酸性风味物质显著增加。
转录组学的研究结果发现，外源性添加AHLs能显著调控P.azotoformans(a)和S.liquefaciens这两株菌相关基因的表达，且上调基因明显多于下调基因。AHLs对这两株菌在生长代谢、产腐败酶和生物被膜形成这三大方面均起到调控作用。编码与细菌生长代谢密切相关的基因（核糖体、氧化磷酸化、糖酵解、TCA循环、蛋白质转运、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、嘌呤代谢、抗胁迫等）上调后，促进细菌的生长代谢，并导致环境中菌液的浓度更高；环境中菌液浓度的升高加速细菌生物被膜的形成，此外，编码与生物被膜形成（主要为细菌鞭毛结构）密切相关的基因上调后，细菌的生物被膜形成能力提高；环境中菌液浓度的升高也会提高环境中腐败酶的总量，且编码与分泌腐败酶相关的基因上调后也会提高细菌产腐败的能力。此外，AHLs对菌株的调控作用呈现出信号分子种类、菌株的依赖性，即不同AHLs对不同株菌的基因和具体的代谢途径的调控作用存在差异。
采用分离培养结合RAPD-PCR技术，将16个地区/牧场的原料奶样品中的480株嗜冷菌聚类成85个RAPD组，且经16S rRNA鉴定后发现优势菌属依次为假单胞菌属（58.8%）、不动杆菌属（13.3%）、黄杆菌属（6.0%）、鞘氨醇杆菌属（4.2%）和沙雷氏菌属（3.1%）；而在种水平上的优势菌种为Pseudomonas fluorescens（15.8%）、Pseudomonas fragi（7.1%）、Pseudomonas psychrophila（5.4%）、Acinetobacter johnsonii（5%）、Pseudomonas putida（4.6%）和Pseudomonas azotoformans（3.8%）。同种、不同株的嗜冷菌（如P.fluorescens，P.fragi，P.psychrophila等）RAPD分子指纹图谱存在种内差异。此外，Acinetobacter harbinensis，Acinetobacter oryzae等嗜冷菌首次在原料奶中被分离鉴定到。
假单胞菌属、不动杆菌属、黄杆菌属、产吲哚金黄杆菌属、沙雷氏菌属和产气单胞菌属不仅是原料奶中的优势菌属，也是重要的产腐败酶来源，它们在室温和低温下都有较强的产腐败酶的能力。大多数蛋白酶和脂肪酶经热处理（70℃、80℃和90℃）后仍有酶活残留，代表性嗜冷菌株所分泌的蛋白酶和脂肪酶的酶灭活热力学参数也证实这些酶具有较高的热稳定性。嗜冷菌产腐败酶是一个依赖于生长温度的过程，生长温度对其分泌腐败酶的能力影响显著，但对腐败酶的耐热性并无显著影响。
大多数嗜冷菌在低温下（7℃）具有生物被膜形成能力（OD595值的范围为0.087-1.324），72个RAPD组中有25株、10株和19株菌分别呈弱、中等和强生物被膜形成能力，且假单胞菌属菌株的生物被膜形成能力显著强于其它属的菌株。不同培养基对嗜冷菌生物被膜的形成有影响，与脱脂牛奶相比（1.04-6.1log CFU/cm2），嗜冷菌在TSB中更容易在不锈钢表面形成生物被膜（1.15-6.63log CFU/cm2）。96孔板法和不锈钢片表面吸附法这两种方法之间呈现出中等相关性（r=0.42），证明采用这两种方法评估微生物生物被膜形成的可靠性。嗜冷菌的生物被膜形成能力存在异质性，即同种、不同株的嗜冷菌形成生物被膜的能力存在差异。
嗜冷菌之间的相互作用对生物被膜的形成和消毒剂的抗性影响显著。Pseudomonas libanensis能提高Chryseobacterium oncorhynchi和Aeromonas hydrophila生物被膜的形成能力，且P.libanensis与C.oncorhynchi呈协同效应关系。与单一菌落形成的生物被膜相比，二元混合菌生物被膜模型（P.libanensis+A.hydrophila、P.libanensis+C.oncorhynchi）对过氧乙酸、过氧化氢和次氯酸钠这三种消毒剂抗性均显著提高。过氧乙酸对单菌、混合菌形成的生物被膜清除率最高，其次为过氧化氢和次氯酸钠。平板计数法和CLSM观察分析法均能有效评估不同消毒剂处理对生物被膜的影响，这两种方法间相关性好。
采用报告平板法筛选能产AHLs信号分子的嗜冷菌，阳性检出率为71.43%；进一步使用LC-MS鉴定代表菌株P.azotoformans(a)和Serrita liquefaciens产AHLs的种类，发现P.azotoformans(a)产C6-HSL，而S.liquefaciens产C8-HSL。外源性添加C6-HSL和C8-HSL对P.azotoformans(a)和S.liquefaciens的生长、分泌腐败酶以及生物被膜的形成均有显著的促进作用。外源性添加C6-HSL和C8-HSL也加速P.azotoformans(a)和S.liquefaciens对牛奶的腐败作用，其中牛奶的粒径大小显著增大、牛奶中的酸性风味物质显著增加。
转录组学的研究结果发现，外源性添加AHLs能显著调控P.azotoformans(a)和S.liquefaciens这两株菌相关基因的表达，且上调基因明显多于下调基因。AHLs对这两株菌在生长代谢、产腐败酶和生物被膜形成这三大方面均起到调控作用。编码与细菌生长代谢密切相关的基因（核糖体、氧化磷酸化、糖酵解、TCA循环、蛋白质转运、氨基酸代谢、脂肪酸代谢、嘌呤代谢、抗胁迫等）上调后，促进细菌的生长代谢，并导致环境中菌液的浓度更高；环境中菌液浓度的升高加速细菌生物被膜的形成，此外，编码与生物被膜形成（主要为细菌鞭毛结构）密切相关的基因上调后，细菌的生物被膜形成能力提高；环境中菌液浓度的升高也会提高环境中腐败酶的总量，且编码与分泌腐败酶相关的基因上调后也会提高细菌产腐败的能力。此外，AHLs对菌株的调控作用呈现出信号分子种类、菌株的依赖性，即不同AHLs对不同株菌的基因和具体的代谢途径的调控作用存在差异。