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背景ENU化学诱变是正向遗传学中最经典高效的方式,是识别新基因并用以解析哺乳动物免疫系统分子基础的强有力工具。T细胞作为机体适应性免疫的主要细胞群,承担着辅助机体抵抗病原体入侵、防御感染的重要作用。CD4蛋白是T细胞活化的共受体,结构性研究已说明T细胞表面存在着CD4的四个胞外域,其中就包括与MHCII配体相连的第一个胞外域。但是关于活体模型中CD4胞外域与MHCII的联系发生机制,目前尚没有明确的研究和报道。目的利用ENU诱变在常用近交系小鼠C57BL/6J品系中建立免疫缺陷小鼠模型,探究得到的CD4辅助T淋巴细胞完全缺失表型的分子机制,在活体中研究CD4第一个胞外域的关键作用,以期建立研究CD4 T细胞的最佳小鼠模型。方法1.以近交系小鼠的典型代表C57BL/6J品系作为基因诱变的对象。选取8周龄的C57BL/6J雄鼠30只进行腹腔ENU注射诱变,注射剂量为90mg/kg体重,按照每周一次的注射方式,连续注射三次。待经过诱变处理的雄鼠度过不育期,长至15周龄时,与野生型C57BL/6J雌鼠1:1进行合笼交配,作为G0构建加系。待生产的同一窝G1在哺育期结束后进行雌雄交配得到G2,再将同一窝生产的G2交配最终得到带有纯合突变的G3,即后续进行表型分析的活体对象。2.利用眼内眦静脉采血法取G3代小鼠抗凝血约100μl,取30μl血样与10μl抗体mix在流式管中混匀,冰上孵育30min;向其中加入400μl用蒸馏水与10xBD FACS裂解液稀释成的1x裂解液,室温避光孵育10min以裂解红细胞;流式上样分析。3.设计突变的Cd4基因序列,利用限制性内切酶克隆到哺乳动物表达载体PCI-Neo,得到瞬转质粒:pCI-mCD4。将与Cd4基因共表达的T2A-EGFP片段克隆到同样的酶切位点,得到最终的转染质粒pCI-mCD4-EGFP。4.将质粒及对照分别导入人HEK 293T细胞,转染24小时后在荧光显微镜下查看转染情况,并进行流式荧光检测。5.取CD3e敲除(CD3-/-)的小鼠作为受体对照,用磁珠试剂盒将Ly5.1Foxp3-eGFP供体小鼠脾脏和淋巴结中的CD4 T细胞纯化出来,分别球后注射入对照和突变小鼠。过继转移6周后,取受体鼠血样和脾脏淋巴结细胞进行流式分析,检测T细胞和调节T细胞的比例和变化情况。结果1.得到CD4 T细胞缺失的突变家系:在G3代小鼠血液样品中,CD4 T细胞完全缺失,而其它淋巴细胞的比例分布正常。将有表型突变小鼠与野生小鼠杂交得到CD4 T细胞比例正常的子代,且G3子代符合孟德尔遗传定律,此突变为常染色体的性遗传。2.通过外显子捕获和下一代基因测序技术,确认导致CD4 T细胞完全缺失是位于6号染色体上的Cd4基因124873055位T→A的点突变,导致编码区第99位氨基酸发生由异亮氨酸到天冬酰胺的错义突变。3.此CD4缺失突变模型使Cd4完全丧失了在T细胞发育中的作用,造成CD4 T淋巴细胞完全缺失。4.CD4第99位氨基酸由异亮氨酸到天冬酰胺的突变不影响CD4蛋白在细胞表面的表达。5.C57BL/6J背景下,ENU诱变得到CD4T细胞缺失的小鼠可作为包括过继转移实验在内研究CD4 T细胞的理想模式动物。结论ENU诱变导致C57BL/6J品系小鼠6号染色体Cd4基因124873055位碱基发生T→A的点突变,致使CD4第99位氨基酸由异亮氨酸突变为天冬酰胺,得到CD4辅助T细胞完全缺失的小鼠模型,此突变小鼠可作为过继转移实验研究CD4 T细胞的最佳模型。