论文部分内容阅读
研究背景:卵巢上皮细胞癌目前仍是严重威胁广大妇女健康的恶性肿瘤。寻求传统手术、放化疗之外的新的疗法十分必要。在卵巢癌的生物治疗中，基因治疗备受瞩目。已有愈来愈多的转基因治疗进入临床研究。为了防止促凋亡基因对正常细胞的毒性作用，实现治疗基因在肿瘤组织中的靶向表达十分必要。应用肿瘤特异性启动子(TSP)对治疗基因进行转录水平调控，再通过对病毒包膜基因进行修饰，改变病毒对细胞的CAR嗜性为整合素嗜性，来提高病毒对卵巢癌细胞的感染水平，是行之有效的方法之一。
研究目的:检测hTERT启动子转录增强系统(TSTA-hTERTp)在卵巢癌细胞及正常细胞中的转录活性。
研究方法:应用Ad-Max系统将各重组腺病毒载体包装成重组腺病毒并鉴定、纯化及扩增。
应用荧光显微镜检测各启动子系统调控下表达EGFP的重组腺病毒感染卵巢癌细胞系OVCAR3、HO8910，SKOV3，宫颈癌细胞系Hela及正常人脐血内皮细胞系ECV304后EGFP的表达情况，应用CCK-8试剂可简便而准确的进行细胞增殖和毒性分析，并应用流式细胞术的荧光激活细胞分类器(FACS)对感染的不同细胞进行荧光定量检测，检测细胞的发光强度。
研究结果:
1、载体构建与病毒制备：成功制备RGD修饰型腺病毒载体CTD010-1及CTD011-4;成功制备表达CMV启动子启动子及TSTA-hTERTp调控下EGFP的重组腺病毒，分别命名为Ad-EGFP和Ad-hTERT-TSTA-EGFP。
2、各启动子系统在卵巢癌细胞和正常细胞中的转录活性：Ad-hTERT-TSTA-EGFP感染后卵巢癌细胞系OVCAR3、HO8910和宫颈癌细胞系Hela中的EGFP阳性细胞数和绿色荧光强度均高于Ad-EGFP感染者。其中hTERT活性相对较高的OVCAR3、HO8910和Hela细胞经Ad-hTERT-TSTA-EGFP感染后其EGFP表达水平分别是Ad-EGFP感染后的4倍、1.6倍和2.6倍；SKOV3细胞经Ad-hTERT-TSTA-EGFP感染后的EGFP表达水平较低，但经Ad-EGFP感染后的EGFP的表达水平与OVCAR3、HO8910和宫颈癌细胞系Hela无明显差异。在hTERT活性极低的ECV304中，Ad-hTERT-TSTA-EGFP感染后的EGFP表达水平只相当于背景水平，相当于Ad-EGFP感染的0.0067倍。
研究结论:TSTA-hTERTp系统可以显著增强其在hTERT阳性的卵巢癌细胞中的转录活性，而不增强其在hTERT阴性细胞中的转录活性。TSTA-hTERTp系统是实现治疗基因靶向表达的较理想的转录工具，可望用于进一步的临床治疗中。