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比目鱼类(鲽形目)的变态发育导致身体左右不对称的产生,是自然界中十分奇特的现象。虽然甲状腺激素已公认是调控比目鱼类的变态发育,但甲状腺激素如何调控比目鱼变态导致的左右不对称产生,目前还不清楚。为了从基因组学的角度,筛选与左右不对称发育相关的基因,本研究论文调查了变态期牙鲆基因和microRNA转录谱,为下一步筛选相关基因奠定物质基础。
目前还没有牙鲆变态期基因转录谱研究的报道,本研究构建了牙鲆变态发育期间的EST(表达序列标签)文库,并对文库进行了随机测序和序列分析。结果表明:一共进行了2193个成功反应,其中2149条ESTs为有效序列,初步拼接得到1049个单基因簇(Unigene),其中包括264个重叠群(Contigs),785个单拷贝EST(Singletons)。使用BLAST软件将这些序列同GenBank等数据库进行比对、查询和注释,结果显示656条序列有相关同源性,其他的393(37.5%)条序列没有明显的同源性(E-values≤1E-5),是新发现的基因。
鉴于许多miRNAs对生物疾病、生长、发育等各方面的调控作用,为了了解微小RNA(microRNAs;简称miRNAs)在比目鱼左右不对称发育中的可能作用,本研究克隆了牙鲆变态发育时期的miRNAs,分析测得的序列,获得23种miRNA,属于17种miRNA家族。其中19种序列与已知miRNAs相同,4种序列不与已知的任意一种miRNA完全相同,是牙鲆特有的miRNA序列。此外,利用荧光实时定量RT-PCR,调查了这23种miRNAs在牙鲆变态发育过程中的变化。发现这些miRNAs在牙鲆变态发育前后都有表达,相比变态发育初期和高峰期(17、19、23DAH),变态发育完成后(27DAH)大部分miRNAs的表达量都急剧下降。除了pol-miR-221,pol-miR-724外,pol-miR-l,pol-miR-7a,pol-miR-7j,pol-miR-7e/7f,pol-miR-9*,pol-miR-20c,pol-miR-21a,pol-miR-23c,pol-miR-125b,pol-miR-128,pol-miR-181a,pol-miR-181e,pol-miR-181f的表达量呈现为逐渐降低趋势,暗示这些miRNAs可能与牙鲆变态发育过程的一系列变态事件有关;pol-miR-10b,pol-miR-23a,pol-miR-26a,pol-miR-130c,pol-miR-145,pol-miR-200a,pol-miR-429在17DAH与19DAH时表达量变化不明显,但在23DAH时显著升高,27DAH时又明显下降。表明这些miRNAs可能不全程参与变态发育的调控。
此外,针对本实验室构建的EST文库,我们通过RNA22软件对克隆得到的miRNAs可能的靶基因进行了预测,得到符合条件的基因31个,选取其中24个与microRNA的5第一个碱基开始连续有8个或8个以上碱基互补配对的基因,对其,在牙鲆变态前后的表达情况进行实时定量分析,发现这些基因在牙鲆变态前后都有表达,其中13个基因在变态初期(19DAH)的表达量明显高于其它几个时期,DCK、MT-ND4L、HFE这三个基因在17DAH、19DAH表达量略高于23DAH和27DAH,CYP1A1、ELA2A、CK1、TNNC2这四个基因的表达量从17DAH至27DAH基本上呈上升趋势,表明它们可能分别对这些时期牙鲆的生长发育更为重要。OAZ、ATCAY和AHCYL的表达量在牙鲆变态前后变化不明显,表明这几个基因不全程参与牙鲆变态发育过程的调控。
同时,为了调查表皮细胞分裂原epigen是否与牙鲆变态发育有关,利用荧光实时定量RT-PCR,调查了epigen基因在牙鲆眼睛移动过程中的变化。相比眼睛移动之前(17DAH),epigen基因在眼睛移动初期(19DAH)表达明显增强,为17DAH时的2.363倍;而在眼睛移动过程的高峰期(23DAH),表达量明显回落,相对19DAH的表达量降低了80%:变态结束后27DAH,epigen基因的表达没有重新增强或进一步的回落,提示epigen基因可能与眼睛移动初期的变态发育事件有关,而与变态高峰期和变态后期的发育事件关系不明显。